HPLC per grandi molecole

HPLC a fase inversa per biomolecole

L'HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è una tecnica sensibile e versatile utilizzata per separare e analizzare proteine, frammenti proteici e peptidi. La RP-HPLC utilizza una fase stazionaria non polare e una fase mobile polare. La ritenzione di proteine e peptidi sulla fase stazionaria segue i principi di adsorbimento e partizione. Le regioni idrofobiche delle proteine si attaccano reversibilmente alla fase stazionaria. Le proteine vengono eluite aumentando la natura non polare della fase mobile. La risoluzione può essere influenzata dalla dimensione dei pori, dalle dimensioni delle particelle, dalla lunghezza della colonna e dalla catena di idrocarburi attaccata alla fase stazionaria.

Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)

La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è una modalità cromatografica non denaturante che separa le molecole in base alle loro dimensioni (cioè il raggio idrodinamico). Questa modalità non si basa sull'interazione dell'analita con la fase stazionaria, ma piuttosto sul flusso casuale dell'analita attraverso le particelle della fase stazionaria. Gli analiti ad alto peso molecolare eluiscono prima, in quanto sono completamente o parzialmente esclusi dai pori della fase stazionaria, mentre gli analiti a basso peso molecolare eluiscono più tardi, in quanto impiegano più tempo a percorrere il tortuoso percorso attraverso la particella. La SEC è stata utilizzata per caratterizzare aggregati e frammenti di anticorpi monoclonali (mAbs), stimare pesi molecolari sconosciuti di proteine e determinare la stabilità delle formulazioni proteiche.

Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)

La cromatografia a interazione idrofobica (HIC) è una modalità cromatografica che separa gli analiti in base al grado di interazione tra le società idrofobiche dell'analita e i ligandi idrofobici della fase stazionaria. A causa del loro basso peso molecolare e della minore propensione al ripiegamento, l'HIC non viene solitamente utilizzata per la separazione dei peptidi. In presenza di alte concentrazioni di sale, gli strati di idratazione delle proteine possono essere sufficientemente perturbati da permettere alle regioni superficiali idrofobiche di interfacciarsi con la fase stazionaria non polare. La selezione dei sali è dettata dalla serie di Hofmeister, che classifica i cationi e gli anioni in base alla loro capacità di interrompere gli strati di idratazione delle proteine (caotropici) o di promuovere la formazione di strati di idratazione delle proteine (kosmotropici). I sali tipici sono il solfato di ammonio, il solfato di potassio e il solfato di sodio. La cromatografia a interazione idrofobica viene attualmente utilizzata per determinare il profilo del rapporto farmaco-anticorpo (DAR) dei coniugati anticorpo-farmaco (ADC).

Ion Exchange Chromatography (IEX)

La cromatografia a scambio ionico (IEX) è una modalità di cromatografia che separa gli analiti in base alla carica. Le proteine e i peptidi sono anfoteri, cioè presentano funzionalità sia acide che basiche. Le funzionalità acide delle proteine includono l'acido aspartico, l'acido glutammico, la cisteina, la tirosina e l'α-carbossilato del C-terminus. Le funzionalità proteiche di base includono arginina, istidina, lisina e l'α-amina dell'N-terminale. Le varianti di carica bioterapeutiche possono essere rilevate e risolte con l'IEX. Le varianti di carica possono derivare da una trascrizione errata dell'RNA messaggero (mRNA) e/o da modifiche post-traduzionali, come la deamidazione, l'ossidazione o la glicosilazione.

Una colonna IEX deve essere selezionata in base al punto isoelettrico (pI) dell'analita. Se il pH della fase mobile è inferiore al pI, l'analita sarà carico positivamente e si legherà a una colonna a scambio cationico.Se il pH della fase mobile è superiore al pI, l'analita sarà carico negativamente e si legherà a una colonna a scambio anionico.

Affinity Chromatography

La cromatografia di affinità si basa su un'interazione specifica tra un analita e il ligando della fase stazionaria. Idealmente, solo l'analita di interesse si interfaccia con la fase stazionaria, permettendo a tutti gli altri componenti del campione di passare attraverso la colonna. Una seconda fase mobile viene quindi fatta passare attraverso la colonna per eluire l'analita.

La cromatografia con proteina A è la forma più comune di cromatografia di affinità utilizzata nell'industria biofarmaceutica. La proteina A è una proteina di superficie di 42 kDa presente nella parete cellulare di S. aureus.Questa proteina si lega specificamente alla catena pesante della regione Fc delle IgG, rappresentando un meccanismo ideale per separare le IgG da altri componenti del campione. La maggior parte delle colonne di Proteina A sono prodotte immobilizzando la proteina su una particella organica porosa. Tuttavia, sono stati prodotti formati monolitici per la cromatografia della Proteina A, che consentono un'elevata produzione di campioni a varie velocità di flusso, senza sacrificare l'efficienza.