HPLC per piccole molecole

HPLC di piccole molecole

L'analisi HPLC di piccole molecole viene eseguita il più delle volte in modalità di separazione a fase inversa. Per la separazione di composti polari sono adatte anche la cromatografia a interazione idrofila (HILIC) e la cromatografia in fase normale, con l'HILIC come metodo preferito. Per la separazione di composti ionici, si possono utilizzare modalità di separazione a scambio ionico e per anioni o cationi inorganici, la cromatografia ionica.

La colonna HPLC è impaccata con particelle di silice completamente porose, particelle di silice superficialmente porose, particelle polimeriche o consiste in un asta di silice monolitica come fase stazionaria. Inoltre, si utilizzano ossido di allumina, particelle di zirconia e particelle di carbonio. La dimensione tipica dei pori del materiale della fase stazionaria per la separazione di piccole molecole è compresa tra 60 Å e 160 Å. Per l'HPLC la dimensione tipica delle particelle della fase stazionaria varia da 3 µm a 5 µm, mentre per l'UHPLC si utilizzano particelle di dimensioni inferiori, in genere 2 µm o meno. Alla fase stazionaria possono essere applicate diverse selettività di colonna (modifiche). Una catena alchilica C18 è la chimica di colonna più comunemente utilizzata nella cromatografia in fase inversa (RP). Tuttavia, altre modifiche, come C30, C8, fenile, pentaflourofenile e un'ampia gamma di modifiche più polari, nonché modifiche con proprietà di scambio ionico o chirali, consentono la separazione di quasi tutti i composti solubili nei liquidi. La fase mobile per l'RP-HPLC consiste tipicamente in un tampone acquoso o in acqua e in solventi organici miscibili con l'acqua, come l'acetonitrile o il metanolo.

Preparazione del campione HPLC

Campioni complessi e ricchi di matrice, come alimenti, bevande, cosmetici, campioni biologici e formulazioni farmaceutiche ricche di matrice (ad es. creme, sciroppi) richiedono protocolli di preparazione del campione efficienti per rimuovere i componenti indesiderati ed estrarre selettivamente l'analita di interesse. Ciò è fondamentale se si utilizza una fase stazionaria con particelle di dimensioni molto ridotte, come nel caso dell'UHPLC, dove si utilizzano particelle di 2 µm o inferiori. I metodi comuni di preparazione del campione sono l'estrazione liquido-liquido, l'estrazione in fase solida (SPE) e, per i campioni biologici, anche la precipitazione delle proteine accanto alla filtrazione. Oltre all'eluizione selettiva del composto target e alla preconcentrazione, lo scopo principale della preparazione del campione è quello di proteggere la fase stazionaria HPLC dall'intasamento causato dalla matrice del campione. Le colonne HPLC basate su la silice monolitica è in grado di tollerare la matrice in misura elevata e richiede una preparazione del campione molto inferiore rispetto alle colonne di particelle. 

Derivatizzazione

Per alcune molecole è necessaria la derivatizzazione, sia prima (pre-colonna) che dopo (post-colonna) la separazione HPLC. La derivatizzazione converte le molecole nei loro derivati per migliorare la sensibilità o la ritenzione cromatografica in HPLC. Per la derivatizzazione richiesta si utilizzano reagenti chimici con proprietà fisiche e chimiche desiderate.