Sekvencování

Sangerovo sekvenování

Dříve bylo možné pomocí metod analytické chemie určit složení nukleových kyselin. Fred Sanger a jeho kolegové však vyvinuli metody - zpočátku s využitím radioaktivně značených natrávených fragmentů a dvourozměrné frakcionace -, které umožnily získat jedny z prvních kompletních nukleových sekvencí. Pokroky v této oblasti pokračovaly po několik desetiletí a každé další zlepšení přispělo k rostoucí knihovně sekvenovaných proteinů a genomů. Mezi tato zlepšení patří separace nukleotidů podle délky pomocí gelové elektroforézy a následně kapilární elektroforézy. Navíc začlenění fluorescenčně značených nukleotidů a automatizovaná počítačová analýza každého fragmentu nukleové kyseliny, to vše nyní definuje moderní metodu Sangerova sekvenování.

Metodika sekvenování DNA

Ačkoli se metody sekvenování DNA od vzniku této technologie neustále zdokonalují, několik základních komponent je stále nezbytných a používaných moderními platformami sekvenování DNA. Příprava DNA obvykle zahrnuje izolaci a purifikaci DNA z hostitelského organismu. Další důležité složky, včetně volných bází DNA, primerů DNA, modifikovaných bází DNA obsahujících fluorescenční značky (terminátorové báze) a polymerázy DNA, se přidávají společně do jedné nádoby. Nádoba obsahující všechny tyto složky prostřednictvím řady kroků zahřívání a ochlazování vytvoří knihovnu malých sekvencí DNA vzhledem k sekvenci DNA plné délky, která je předmětem zájmu, přičemž každá z nich je zakončena fluorescenčně značenou terminátorovou bází. Nová vlákna DNA obsahující fluorescenčně značené koncové nukleotidy se oddělí podle délky, projdou kapilární trubicí a uspořádají se podle velikosti. Poté se použije laser k excitaci fluorescenční báze na každém vlákně, zatímco kamera snímá signál. Nakonec se obvykle použije počítač, který shromážděné informace sestaví do sekvence DNA v plné délce.