[Přejít k obsahu](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs) Produkty Nákupní košík0 CZCS Produkty ProduktyAplikaceSlužbyZdrojePodpora [Přihlášení / Registrovat se](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Dohledání objednávky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/order-lookup) [Rychlá objednávka](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/quick-order) Nákupní košík0 [Domů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs)[Extrakce v pevné fázi (SPE)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/applications/analytical-chemistry/sample-preparation/solid-phase-extraction)LC/MS/MS analýza steroidních hormonů v plazmě # LC/MS/MS analýza steroidních hormonů v plazmě __Craig Aurand__ *Reporter US Volume 32.2* Desky HybridSPE®-Fosfolipid zajišťovaly vynikající výtěžnost analytu těchto obtížných sloučenin ze vzorků plazmy s následnou LC/MS/MS analýzou na kolonách Ascentis® Express Fused-Core® C18. Extrakty neobsahovaly endogenní fosfolipidy, které mohou interferovat s kvantifikací, snižovat průchodnost vzorků a zkracovat životnost kolon. ## Úvod Z různých důvodů je stále častější trend převádět některé klinické metody z imunoanalýzy na LC/MS/MS. LC/MS/MS zlepšuje specifičnost testu, není omezena dostupností protilátek a umožňuje provádět multiplexní testy analytů současně. LC/MS/MS však není bez omezení, zejména interferencí z endogenní matrice vzorku, která může mít za následek mimo jiné zdánlivě náhodné a libovolné rozlišení v odezvě analytu1. ## Cíle studie Cíl této studie byl dvojí. Zaprvé vyvinout jednoduchou LC/ MS/MS metodu, včetně přípravy vzorků pomocí HybridSPEFosfolipidových destiček, pro přímou analýzu steroidních hormonů progesteronu, aldosteronu, kortikosteronu, deoxykortikosteronu, testosteronu a 17α-methyltestosteronu z krevní plazmy. Za druhé, porovnání pozadí z matrice vzorku mezi výslednou metodou přípravy vzorku a standardním srážením proteinů. vzorků. ## Experimentální __Chromatografické (LC/MS/MS) podmínky__ Chemické struktury steroidních hormonů jsou uvedeny na __obrázku 1__. Počáteční hodnocení bylo provedeno s použitím směsi steroidních hormonů pro stanovení chromatografických podmínek na koloně Ascentis Express C18. Profil gradientu byl rozšířen tak, aby bylo možné provést sledování matrice pro zpracovanou plazmu   .  __Obrázek 1.__ Struktura steroidních hormonů __HybridSPE-Phospholipid Principy fungování__ Technologie HybridSPE-Phospholipid kombinuje jednoduchou, standardizovanou metodiku srážení proteinů se specifičností extrakce na pevné fázi pro současné odstranění proteinů a fosfolipidů z biologických vzorků. Technologie je založena na hybridních částicích oxidu zirkoničitého a oxidu křemičitého pro cílenou izolaci fosfolipidů, zatímco materiály s PTFE fritami fungují jako hloubkový filtr pro účinné odstranění vysrážených proteinových částic. Zirkoniová část hybridní částice se chová jako Lewisova kyselina (akceptor elektronů), která silně interaguje s Lewisovými zásadami (donory elektronů), jako je fosfátová část fosfolipidů. Tato technologie umožňuje vysoce selektivní odstranění fosfolipidové matrice, přičemž zůstává neselektivní vůči široké škále analytů2. __Vývoj metody přípravy vzorků: Vývoj metody přípravy vzorků spočíval ve stanovení výtěžnosti standardních sloučenin z 96jamkových destiček HybridSPE-Phospholipid a následném převedení těchto podmínek pro použití s hrotovanými vzorky plazmy. Optimalizace metody spočívala ve vyhodnocení několika systémů srážecích rozpouštědel. Jakmile byla stanovena dostatečná výtěžnost analytů pro vzorky plazmy, závěrečná část studie spočívala v porovnání techniky HybridSPE-Phospholipid s běžně uznávanou proteinovou precipitací pro odstranění fosfolipidové matrice.__ __Výběr analytů ze standardního roztoku pomocí HybridSPE-Phospholipid__ __Vývoj metody s 96jamkovou destičkou HybridSPE-Phospholipid začal stanovením výtěžnosti šesti steroidů ze standardních roztoků. Byly vyvinuty kalibrační křivky externích standardů od 10 do 300 ng/ml každé sloučeniny v 1% (v/v) acetonitrilu kyseliny mravenčí:vodě (3:1). Do 96jamkové destičky HybridSPE-Phospholipid byl přidán 300 µl alikvotní podíl standardního roztoku (50 ng/ml). Vakuum bylo aplikováno po dobu 4 minut při 10" Hg. Vzorky byly poté přímo analyzovány.__ __Získání analytů z plazmy pomocí HybridSPE-Phospholipid__ __Primárním rozpouštědlem používaným u HybridSPE-Phospholipid pro precipitaci vzorků plazmy je 1% (v/v) kyselina mravenčí v acetonitrilu. Tento roztok použitý v poměru 3:1 se vzorkem plazmy účinně precipituje plazmatické bílkoviny. Kyselina mravenčí také narušuje vazbu cílových analytů s proteiny, čímž zajišťuje zvýšenou citlivost. U analytů s chelatačními vlastnostmi však použití 0,5 % (w/v) kyseliny citronové v acetonitrilu jako precipitační přísady a v předkondicionovacím kroku výrazně zvyšuje jejich výtěžnost z částic oxidu zirkoničitého a oxidu křemičitého.__ __Systém kyseliny mravenčí: 1% (v/v) kyselina mravenčí v acetonitrilu:voda (3:1)__ __Plazma potkanů stabilizovaná pomocí K2EDTA (Lampire Biological Laboratories, Pipersville PA) byla obohacena o analyty ze standardního roztoku. Na destičku HybridSPE-Phospholipid byl přidán alikvot 100 µl a následně 300 µl srážecího rozpouštědla s 1% kyselinou mravenčí a acetonitrilem. Destička byla 4 minuty míchána vortexem, umístěna na vakuový rozdělovač a vystavena vakuu 10" Hg po dobu 4 minut. Filtrát byl odebrán a analyzován přímo. Koncentrace steroidních hormonů v konečném vzorku byla ekvivalentní 50 ng/ml. Výtěžnost byla založena na interpolaci standardní křivky analytů v pufru.__ __Systém kyseliny citronové: 0,5% (w/v) kyselina citronová v acetonitrilu, pro chelataci sloučenin__ __Postup s kyselinou citronovou byl stejný jako postup s kyselinou mravenčí popsaný výše, s výjimkou těchto dvou kroků: Srážecím rozpouštědlem byla 0,5% (w/v) kyselina citronová v acetonitrilu. Destička HybridSPE-Phospholipid byla nejprve předkondicionována 300 µl/jamku 0,5% (w/v) kyseliny citronové v acetonitrilu.__ __Monitorování fosfolipidů z matrice vzorku plazmy__ __Spikované vzorky plazmy byly precipitovány pomocí 0,5% kyseliny citronové v acetonitrilu a analyzovány přímo. Monitorování fosfolipidů bylo provedeno pomocí Q3 plného skenování spolu se skenováním prekurzorových iontů 104 m/z. Gradientní chromatografické podmínky použité pro analýzu umožňují eluci fosfolipidů za podmínek vysokého obsahu organických látek.__ ## Výsledky a diskuse Gradientová eluce šesti steroidních hormonů na přístroji Ascentis Express C18 s detekcí LC/MS/MS je znázorněna na __obrázku 2__.  __Obrázek 2.__ LC/MS/MS analýza steroidních hormonů __Podmínky__ Kolona: Ascentis Express C18, 10 cm x 2,1 mm I.D., 2,7 µm (č. produktu  [53823-U](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/supelco/53823U)); __mobilní fáze:__ (A) 5 mM mravenčan amonný, pH 4.0 s kyselinou mravenčí; (B) methanol; __gradient:__ 60 % B po dobu 3 min, na 95 % B za 5 min, udržováno při 95 % B po dobu 2 min; __průtoková rychlost:__ 0.3 ml/min; __teplota kolony:__ 50 °C; __tlak:__ 90 barů __detektor:__ ESI(+), MRM; __injekce:__ 2 µl; __vzorek:__ 50 ng/ml každé sloučeniny; __systém:__ Shimadzu LC-30AD, LCMS-8030 __Výtěžnost analytu__ __Tabulka 1__ .uvádí údaje o výtěžnosti steroidních sloučenin extrahovaných destičkami HybridSPE-Fosfolipid ze standardního roztoku pomocí systému s kyselinou mravenčí a ze spikované plazmy pomocí systémů s kyselinou mravenčí a kyselinou citronovou. Tabulka uvádí průměrnou zjištěnou koncentraci, směrodatnou odchylku a variační koeficient (% c.v.) opakovaných vzorků (n=8). V systému s kyselinou mravenčí byla u standardních roztoků pozorována špatná výtěžnost a vysoká variabilita aldosteronu, kortikosteronu a deoxykortikosteronu. To je způsobeno chelatací kombinovaného místa karbonyl/karboxylová kyselina na těchto molekulách se zirkoniokřemičitým povrchem částic HybridSPE-fosfolipid. Struktury aldosteronu a progesteronu lze porovnat na __obrázku 1__. Všimněte si polohy karbonylové a hydroxylové skupiny, které dávají aldosteronu jeho chelatační tendenci. Předpokládalo se, že výtěžnost analytu z HybridSPE-fosfolipidu bude vyšší při extrakci ze séra nebo plazmy ve srovnání se standardními roztoky. Je to proto, že fosfolipidy jsou ve vzorku plazmy ve vysokém množství a silně interagují s molekulami zirkonia kyseliny Lewisovy na částicích HybridSPE-Phospholipid, čímž dochází k maskování těchto míst před citlivými analyty. __Tabulka 1B__ tento předpoklad potvrzuje; výtěžnost a variabilita kortikosteronu a deoxykortikosteronu extrahovaných z plazmy se oproti extrakci vodných standardů výrazně zlepšila. Výtěžnost aldosteronu z plazmy však byla v systému s kyselinou mravenčí stále velmi špatná. Nahrazením kyseliny mravenčí kyselinou citronovou je chelatační jev překonán. Kyselina citronová se chová jako chelatační činidlo, a pokud je využita jako přísada pro HybridSPE-fosfolipid, působí navázání na povrch zirkonia. Předkondicionování destiček kyselinou citronovou zabraňuje zadržení chelatačních sloučenin, ale nebrání selektivnímu zadržení fosfolipidů. __Tabulka 1C__ ukazuje, že použití kyseliny citronové jako srážecí přísady spolu s krokem předkondicionování výrazně zvyšuje výtěžnost a reprodukovatelnost chelatačních sloučenin z částic HybridSPE-Fosfolipid. __Analyt____Zjištěná__ __koncentrace____Std. Dev. (n=8)____% cv.__ __A. Standardy (50 ng/ml) v 1% acetonitrilu kyseliny mravenčí__ Aldosteron2,701,8367.75 Deoxykortikosteron25,131,044.15 Kortokosteron14,762,4616.65 Progesteron57,270.951,66 Testosteron59,231.161,96 17α-Methyltestosteron57.151,212,11 __B. Špičková plazma (50 ng/ml) extrahovaná systémem kyseliny mravenčí__ Aldosteron1,870,8344.39 Deoxykortikosteron54,581,102.02 Kortokosteron54,313,867.11 Progesteron54,090.991,83 Testosteron55,750.761,36 17α-Methyltestosteron54.300,931,71 __C. Špičková plazma (50 ng/ml) extrahovaná pomocí systému kyseliny citronové__ Aldosteron45,031,897.55 Deoxykortikosteron54,322,554.10 Kortokosteron56,233,915.47 Progesteron51,401.584,30 Testosteron51,661.283,62 17α-Methyltestosteron61.681,533,76 Tabulka 1.Zpětné získávání analytů z destiček HybridSPE-fosfolipidů __Monitorování koextrahované fosfolipidové matrice__ __Na obrázku 3__ jsou uvedeny chromatogramy monitorování matrice pro techniku HybridSPE-Fosfolipid a srážení proteinů. Vzorky plazmy zpracované technikou HybridSPE-Phospholipid neměly ve srovnání se standardní technikou srážení proteinů žádné detekovatelné matricové interference. Ačkoli fosfolipidová matrice ze standardní techniky srážení proteinů se přímo nesrážela s cílovými analyty, stále by to představovalo problém pro zanášení MS zdroje. Fosfolipidová matrice by vedla k chromatografickému přenosu do následných vzorků, což by mělo za následek náhodné interference a potenciální selhání kolony.  __Obrázek 3.__ Sledování koextrahované fosfolipidové matrice __Podmínky__ __kolona:__ Ascentis Express C18, 10 cm x 2,1 mm I.D., 2,7 µm (č. výrobku  [53823-U](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/supelco/53823U)); __mobilní fáze:__ (A) 5 mM mravenčan amonný, pH 4.0 s kyselinou mravenčí; (B) methanol; __gradient:__ 60 % B po dobu 3 min, na 95 % B za 5 min, udržováno na 95 % B po dobu 2 min; __průtoková rychlost:__ 0.3 ml/min; __teplota kolony:__ 50 °C; __tlak:__ 90 barů __detektor:__ ESI(+), MRM; __vstřik:__ 2 µl; __vzorek:__ 50 ng/ml každé sloučeniny; __systém:__ Shimadzu LC-30AD, LCMS-8030 ## Shrnutí Systém 0,5% kyseliny citronové a acetonitrilu na destičkách HybridSPE-Phospholipid poskytl vynikající výtěžnost analytu a vysokou účinnost odstranění fosfolipidů ze vzorků plazmy. Tato studie ukazuje, že existují jednoduché a účinné přístupy, které lze použít v případě obzvláště obtížných analytů. V prezentovaném příkladu byla původně špatná výtěžnost chelatačních steroidních sloučenin v systému s kyselinou mravenčí překonána použitím systému s kyselinou citronovou, který eliminoval chelatační interakce. Metoda poskytla vysokou výtěžnost a nízkou variabilitu všech testovaných steroidů jak ze standardních roztoků, tak ze vzorků plazmy s příměsí. Systém kyseliny citronové byl také velmi účinný při odstraňování endogenních fosfolipidů z matrice. Závěrem lze říci, že s mírnou modifikací obecného protokolu se ukázalo, že HybridSPE-Phospholipid je účinný při redukci matrice a zároveň poskytuje vynikající výtěžnost obtížných, chelatujících analytů. HybridSPE-Phospholipid je jednoduchá a účinná technika přípravy vzorků pro LC/MS pro snížení matricových efektů při LC/MS analýze biologických vzorků. ## Materiály Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba. Response not successful: Received status code 500 1\. Aurand C. Understanding, Visualizing, and Reducing the Impact of Phospholipid-Induced Ion Suppression in LC-MS; Supelco Reporter. 30.2: 10-12 2\. HybridSPE-Phospholipid Technology Home Page.. __Související články__ - [Metodika SPE v obrácené fázi](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/solid-phase-extraction/reversedphase-methodology) - [Rezidua veterinárních léčiv](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/food-and-beverage-testing-and-manufacturing/chemical-analysis-for-food-and-beverage/veterinary-drug-residues) - [Empowering Biochemists to Analyze Glycoproteins with Exceptional Reproducibility](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/large-molecule-hplc/bioshell-glycan-hplc-columns) - [Biological Testing for Amphetamine and Methamphetamine Abuse](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/biological-testing-for-amphetamine-and-methamphetamine-abuse) - [Accurate Biological Testing for Amphetamine and Methamphetamine Abuse Using Chiral HPLC and MS Detection](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/chiral-hplc-amphetamine-methamphetamine) - [UHPLC/MS for Drug Detection in Urine](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/uhplc-analysis-drugs-glucuronidase) - [Acrylamide in Food](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/solid-phase-extraction/acrylamide-in-food) - [Analysis of Melamine in Milk](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/solid-phase-extraction/analysis-of-melamine) - [Zobrazit více](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Související kategorie výrobků__ - [HPLC kolony](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/analytical-chemistry/analytical-chromatography/hplc-columns) - [Extrakce na pevné fázi (SPE) a QuEChERS](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/analytical-chemistry/analytical-sample-preparation/spe-and-quechers) - [Těsnicí fólie, fólie a pásky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Kontrolované látky a normy pro nedovolené drogy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/analytical-chemistry/reference-materials/pharmaceuticals-illicit-drugs-and-diagnostic-biomarkers) Nejvyšší __Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.__ Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet. Přihlásit__Nemáte účet?__Registrovat Toto je strojově přeložená stránka. Podpora[Zákaznická podpora](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/support/customer-support)[Kontaktujte nás](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/offices)[ČASTO KLADENÉ DOTAZY](https://maestro.my.site.com/knowledgeportal/s/)[Bezpečnostní listy (SDS)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/documents-search?tab=sds)[Certifikáty (COA/COO)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/documents-search?tab=coa)[Kvalita a regulace](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/quality-and-regulatory-management)[Kalkulačky a aplikace](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/support/calculators-and-apps)[Webové semináře](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/webinars) Objednávky[Vyhledávání objednávek](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/order-lookup)[Rychlá objednávka](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/quick-order)[Vlastní produkty](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/services/custom-products)[Řešení pro elektronické obchodování](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/ecommerce/ecommerce-solutions) Společnost[O nás](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/about-us)[Odpovědnost](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/ssbi)[Události](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/events)[Tiskové zprávy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/press)[Programy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/partnership-programs)[Kariéra](https://careers.merckgroup.com/global/en)[Kanceláře](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/offices) Sociální média [](https://www.linkedin.com/company/merck-life-science) [](https://x.com/Merck_lifesci) [](https://www.facebook.com/Merck.lifescience) [](https://www.instagram.com/mercklifescience/) [](https://www.youtube.com/@MerckLifeScience/featured) Merck __Výzkum. Vývoj.__ Jsme předním dodavatelem pro světový průmysl Life Science s řešeními a službami pro výzkum, vývoj a výrobu biotechnologií a vývoj a výrobu farmaceutických léčiv. [](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs) [Sigma-Aldrich® Roztoky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/sigma-aldrich)[BioReliance® Řešení](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/bioreliance)[Millipore® Roztoky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/millipore)[SAFC® Řešení](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/safc)[Milli-Q® Roztoky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/milliq)[Supelco® Řešení](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/supelco) © 2026 Merck KGaA, Darmstadt, Německo a/nebo její pobočky. Všechna práva vyhrazena, včetně vytěžování textu a dat pro trénink umělé inteligence a podobných technologií. Reprodukce jakýchkoli materiálů z těchto stránek je bez povolení přísně zakázána. [Podmínky používání webu](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/legal/site-use-terms)|[Zásady ochrany osobních údajů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/legal/privacy-statement)|[Všeobecné podmínky prodeje](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/legal/terms-and-conditions)|[Souhlas s autorskými právy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/legal/copyright-consent)|[Mapa stránek](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/site-map)