[Přejít k obsahu](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs) Produkty Nákupní košík0 CZCS Produkty ProduktyAplikaceSlužbyZdrojePodpora [Přihlášení / Registrovat se](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Dohledání objednávky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/order-lookup) [Rychlá objednávka](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/quick-order) Nákupní košík0 [Domů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs)[Aplikace polymerázové řetězové reakce](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/applications/genomics/pcr)Teplota tání oligonukleotidů # Teplota tání oligonukleotidů __Přehled sekcí__ - [Teoretické metody výpočtu DNA Tm](https://www.sigmaaldrich.com#calulation-methods) - [Krok první: Určení hodnot nejbližšího souseda pro Δh a Δs a součet jednotlivých parametrů](https://www.sigmaaldrich.com#step-one) - [Druhá metoda](https://www.sigmaaldrich.com#secondary-method) - [Kalkulátor sekvencí oligonukleotidů](https://www.sigmaaldrich.com#oligonukleotid) - [Závěr](https://www.sigmaaldrich.com#z%C3%A1v%C4%9Br) ## Jak se vypočítá Tm DNA? Teplota tání (Tm) oligonukleotidu je teplota, při které je 50 % oligonukleotidu duplexováno se svým dokonalým komplementem a 50 % je volných v roztoku. Znalost Tm je kriticky důležitá pro řadu technik v molekulární biologii (např. PCR, Southern blotting, *in situ* hybridizace). Některé z těchto klasických technik se stále hojně využívají ve spojení s novějšími technikami, jako je příprava knihoven vzorků na základě PCR, které mají být použity při sekvenování nové generace. Nejběžnější experimentální metodou pro stanovení Tm je měření změny absorbance oligonukleotidu s jeho doplňkem v závislosti na teplotě ([__obrázek 1__](https://www.sigmaaldrich.com#obr%C3%A1zek1)). Ačkoli experimentálně stanovené hodnoty Tm jsou nejpřesnější, při použití klasických molekulárních technik pro rutinní aplikace nejsou nezbytné. ![Obrázek 1 ukazuje nejběžnější experimentální metodu pro stanovení Tm, kterou je měření změny absorbance oligonukleotidu s jeho komplementem v závislosti na teplotě. ](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/pcr/oligonucleotide.jpg "Obrázek 1 ukazuje nejběžnější experimentální metodu pro stanovení Tm, kterou je měření změny absorbance oligonukleotidu s jeho komplementem v závislosti na teplotě. ") __Obrázek 1. Příklad experimentálního stanovení Tm oligonukleotidu.__ Měření se provádí v termostatované cele UV-Vis spektrofotometru. Tm je údaj v polovině vzdálenosti mezi plošinou dvouvláknové DNA (dsDNA) a plošinou jednovláknové DNA (ssDNA). K výpočtu očekávaného Tm lze použít teoretické metody, které zohledňují pravděpodobnou zamýšlenou techniku i faktory ovlivňující tání (koncentrace sekvence, délka sekvence, složení bází, iontová síla atd.). ## Teoretické Tm DNA Metody výpočtu[](https://www.sigmaaldrich.com) V závislosti na povaze sekvence používáme k výpočtu Tm jednu ze dvou metod: - Nejbližší sousedé - Základní #### Nejbližší sousedé Primární metoda, kterou používáme k výpočtu Tm, je metoda, kterou používáme k výpočtu Tm/sub> je metoda nejbližších sousedů1,2 a používáme ji pro oligonukleotidy s délkou sekvence od 15 do 120 bází (horní hranice délky naší standardní nabídky oligů DNA). Tato metoda je považována za nejpřesnější, protože zohledňuje sekvenci oligonukleotidu, a nikoli pouze složení bází jako ostatní metody. Metoda nejbližších sousedů zohledňuje termodynamické i další faktory, které ovlivňují Tm, včetně koncentrace oligonukleotidů a monovalentních kationtů. Používáme následující modifikovaný vzorec pro nejbližší sousedy: ![Metoda Neighbors je považována za nejpřesnější, protože bere v úvahu sekvenci oligonukleotidu, nikoli pouze složení bází.](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/pcr/melting-temperature-eq1.jpg "Metoda Neighbors je považována za nejpřesnější, protože bere v úvahu sekvenci oligonukleotidu, nikoli pouze složení bází.") __Kde:__ __Tm__ = teplota tání ve °C Δ*H* = změna entalpie v kcal mol-1  (zohledňuje změnu energie během žíhání/tání) *A* = konstanta -0.0108 kcal K-1 ᐧ mol-1 (zohledňuje iniciaci šroubovice během žíhání / tání) Δ*S* = změna entropie v kcal K-1 ᐧ mol-1 (zohledňuje energii neschopnou vykonat práci, tj.tj. neuspořádanost) *R* = plynová konstanta 0.00199 kcal K-1 ᐧ mol-1 (konstanta, která škáluje energii na teplotu) *C* = koncentrace oligonukleotidu v M nebo mol L-1  (používáme 0.0000005, tj. 0,5 µM) -273.15 = konverzní faktor pro změnu očekávané teploty v Kelvinech na °C \[*Na+*] = koncentrace sodíkových iontů v M nebo mol L-1 (používáme 0,05, tj. 50 mM) Existuje konečný počet hodnot nejbližších sousedů pro Δ*H,* Δ*S*.a *A*, které  lze dosadit přímo do výše uvedeného vzorce (__tabulka 1__). __Tabulka 1.__ __Hodnoty nejbližších sousedů pro Δ*H a* Δ*S*.__ V článku, který slouží jako zdroj základního vzorce pro nejbližší sousedy (__odkaz 1__), jsou Δ*S*, *A* a *.R* jsou uváděny v jednotkách cal K-1 ᐧ mol-1, takže pro vyvážení jednotek se ve vzorci násobí koeficientem 1 000 Δ*H*  (uváděným v kcal mol-1). Zde uvádíme Δ*S*, *A* a *R* v jednotkách kcal K-1 ᐧ. mol-1 tak, aby se jednotky pro jednotlivé parametry shodovaly, a aby tedy bylo intuitivnější sledovat níže uvedený příklad výpočtu při rozměrové analýze. Bez ohledu na přístup je vypočtené Tm shodné. Kompletní seznam hodnot ΔH a ΔS, včetně hodnot pro wobble sekvence, získáte od naší skupiny technických služeb na adrese [oligotechserv@sial.com](mailto:oligotechserv@sial.com). | | | | | | | | | | |----------|---------|---------|---------|---------------|----------|----------|----------|----------| | Molekula | DNA | | | __Interakce__ | __Δ*H*__ | __Δ*S*__ | __Δ*H*__ | __Δ*S*__ | | -9.1\** | -0,0240 | -6.6 | -0.0184 | | | | | | | AT/TA | -8.6 | -0.0239 | -5,7 | -0.0155 | | | | | | TA/AT | -6.0 | -0.0169 | -8,1 | -0.0226 | | | | | | CA/GT | -5.8 | -0.0129 | -10,5 | -0.0278 | | | | | | GT/CA | -6.5 | -0.0173 | -10,2 | -0.0262 | | | | | | CT/GA | -7.8 | -0.0208 | -7,6 | -0.0192 | | | | | | GA/CT | -5.6 | -0.0135 | -13,3 | -0.0355 | | | | | | CG/GC | -11.9 | -0,0278 | -8.0 | -0.0194 | | | | | | GC/CG | -11.1 | -0.0267 | -14,2 | -0.0349 | | | | | | GG/CC | -11.0 | -0,0266 | -12.2 | -0,0297 | | | | | \*Levá sekvence je 5' až 3', zatímco pravá sekvence je 3' až 5', např. pro AA/TT je AA 5' až 3' a TT je 3' až 5'. Při výběru hodnot vždy vybírejte ve směru 5' až 3', bez ohledu na to, zda se jedná o levou nebo pravou sekvenci ve správné orientaci. \*\*Záporné hodnoty odrážejí, že žíhání je entalpicky a entropicky výhodné. Kladné hodnoty by odrážely opačnou reakci, tedy tání, a vedly by k identickému výpočtu Tm   __Příklad výpočtu nejbližších sousedů.__ Tento příklad demonstruje ruční výpočet Tm pro následující sekvenci: 5'-AAAAACCCCCGGGGGTTT-3' Toto je výše uvedená sekvence spárovaná se svým reverzním komplementem: 5'-AAAAACCCCCGGGGGTTT-3' 3'-TTTTTGGGGCCCCCAAAAA-5' #### *Krok první:* *Přečtení cílové sekvence 5' až 3', hodnoty ΔH a ΔS pro všechny nejbližší sousedy lze nalézt v tabulce 1. Identifikované dvojice nejbližších sousedů spolu s jejich hodnotami ΔH a ΔS (a součty) jsou následující:* | | | | |----------------------------|--------------|---------------| | Nejbližší sousedé | ΔH | ΔS | | AA/TT | -9.1 | -0.0240 | | AA/TT | -9.1 | -0.0240 | | AA/TT | -9.1 | -0.0240 | | AA/TT | -9.1 | -0.0240 | | GT/CA | -6.5 | -0.0173 | | GG/CC | -11.0 | -0.0266 | | GG/CC | -11.0 | -0.0266 | | GG/CC | -11.0 | -0.0266 | | GG/CC | -11.0 | -0.0266 | | CG/GC | -11.9 | -0.0278 | | GG/CC | -11.0 | -0.0266 | | GG/CC | -11.0 | -0.0266 | | GG/CC | -11.0 | -0.0266 | | GG/CC | -11.0 | -0.0266 | | GT/CA | -6.5 | -0.0173 | | AA/TT | -9.1 | -0.0240 | | AA/TT | -9.1 | -0.0240 | | AA/TT | -9.1 | -0.0240 | | AA/TT | -9.1 | -0.0240 | | *__Překlad: J. Š.Součet__* | *__-185.7__* | *__-0,4672__* | #### *Druhý krok: dosaďte hodnoty do vzorce pro výpočet teploty tání podle nejbližších sousedů* ![vzorec pro nejbližší sousedy](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/pcr/melting-temperature-eq1.jpg "vzorec pro nejbližší sousedy") ![výpočet teploty tání](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/pcr/melting-temperature-eq2.jpg "výpočet teploty tání") __Tm = 69.6 °C__ Pro srovnání uvádíme hodnotu stanovenou pomocí online kalkulátoru oligonukleotidových sekvencí: ![online kalkulátor sekvencí oligonukleotidů](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/pcr/melting-temperature-eq11.jpg "online kalkulátor sekvencí oligonukleotidů") Ručně vypočtená hodnota 69,6 a hodnota vypočtená online kalkulačkou 69,7 (rozdíl je způsoben tím, že původní literární hodnota plynové konstanty 1,987 byla pro tento příklad výpočtu zaokrouhlena na 1,99). Hodnota 69,7 by byla uvedena v technickém listu dodávaném s tímto oligonukleotidem. #### Základní[](https://www.sigmaaldrich.com) Sekundární metoda, kterou používáme k výpočtu T<.sub>m je základní metoda (modifikovaný Marmurův Dotyho vzorec3), kterou používáme pro oligonukleotidy s krátkými délkami sekvencí, tj.tj. ty, které mají 14 bází nebo méně. Tato metoda, částečně odvozená z experimentů s membránovou hybridizací, předpokládá koncentraci primerů 50 nM, koncentraci monovalentních iontů (Na+) 50 mM a pH 7,0. Vzhledem k tomu, že membránové hybridizační experimenty se dnes neprovádějí tak běžně jako před desítkami let, kdy byl tento výzkum původně prováděn, korekční faktor zohledňuje, že oligonukleotid je pravděpodobně volný v roztoku, např. použitý v modernější technice, jako je PCR. Používáme následující modifikovaný vzorec Marmur Doty: __*Tm* = 2(*A* + *T*) + 4(*C* + *G*) - 7__ Kde: *Tm* = teplota tání ve °C *A* = počet adenosinových nukleotidů v sekvenci *T* = počet thymidinových nukleotidů v sekvenci *. C* = počet cytidinových nukleotidů v sekvenci *G* = počet guanosinových nukleotidů v sekvenci G = počet guanosinových nukleotidů v sekvenci i> -7 = korekční faktor zohledňující v roztoku __Příklad výpočtu podle Marmura Dotyho__. Tento příklad bude demonstrovat manuální výpočet Tm pro následující sekvenci: 5'-ACGTCCGGACTT-3' __*Krok první: dosaďte hodnoty do Marmurova Dotyho vzorce pro výpočet teploty tání*__ __*Tm =* 2*(A* + *T)* + 4*(C* + *G)* - 7__ __*Tm* = 2(2 + 3) + 4(4 + 3) - 7__ __*Tm* = 31.0 °C__ Pro srovnání uvádíme hodnotu stanovenou pomocí online kalkulátoru oligonukleotidových sekvencí: ![oligonukleotidová sekvenční kalkulačka](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/pcr/melting-temperature-eq10.jpg "oligonukleotidová sekvenční kalkulačka") Hodnota 31,0 by byla uvedena v technickém listu dodávaném s tímto oligonukleotidem. *Pokud hodláte použít tyto krátké oligonukleotidy pro membránové hybridizační experimenty, doporučujeme k uvedené hodnotě Tm ručně přičíst +7 (tj, výše uvedená hodnota by byla 38 °C).* ## Závěr[](https://www.sigmaaldrich.com) K určení Tm oligonukleotidu se používá jedna ze dvou metod, které jsou optimalizovány pro klasické molekulární techniky. V případě potřeby další pomoci se obraťte na naši skupinu technických služeb na adrese [oligotechserv@sial.com](mailto:oligotechserv@sial.com).. ### Odkazy 1\. Freier SM, Kierzek R, Jaeger JA, Sugimoto N, Caruthers MH, Neilson T, Turner DH. 1986. Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83(24):9373-9377. [https://doi.org/10.1073/pnas.83.24.9373](https://doi.org/10.1073/pnas.83.24.9373) 2\. Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA. 1986. Predicting DNA duplex stability from the base sequence.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83(11):3746-3750. [https://doi.org/10.1073/pnas.83.11.3746](https://doi.org/10.1073/pnas.83.11.3746) 3\. Marmur J, Doty P. 1962. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. Journal of Molecular Biology. 5(1):109-118. [https://doi.org/10.1016/s0022-2836(62)80066-7](https://doi.org/10.1016/s0022-2836%2862%2980066-7) __Související články__ - [Instalace a použití systémů pro čištění vody Milli-Q® SQ *2Series*](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/wet-chemical-analysis/installation-use-of-milli-q-2series-water-purification-system) - [Optimalizovaná detekce mykoplazmy pomocí PCR](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-counting-and-health-analysis/optimized-pcr-based-mycoplasma-detection) - [Výběr rekombinantů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/cloning-and-expression/restriction-enzyme-cloning-manual-recombinants) - [Protokol extrakce DNA z bukální sliznice a amplifikace WGA](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/extraction-protocol-buccal-swab) - [Zobrazit více](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) Nejvyšší __Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.__ Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet. Přihlásit__Nemáte účet?__Registrovat Toto je strojově přeložená stránka. Podpora[Zákaznická podpora](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/support/customer-support)[Kontaktujte nás](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/offices)[ČASTO KLADENÉ DOTAZY](https://maestro.my.site.com/knowledgeportal/s/)[Bezpečnostní listy (SDS)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/documents-search?tab=sds)[Certifikáty (COA/COO)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/documents-search?tab=coa)[Kvalita a regulace](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/quality-and-regulatory-management)[Kalkulačky a aplikace](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/support/calculators-and-apps)[Webové semináře](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/webinars) Objednávky[Vyhledávání objednávek](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/order-lookup)[Rychlá objednávka](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/quick-order)[Vlastní produkty](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/services/custom-products)[Řešení pro elektronické obchodování](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/ecommerce/ecommerce-solutions) Společnost[O nás](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/about-us)[Odpovědnost](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/ssbi)[Události](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/events)[Tiskové zprávy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/press)[Programy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/partnership-programs)[Kariéra](https://careers.merckgroup.com/global/en)[Kanceláře](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/collections/offices) Sociální média [![LinkedIn icon](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/icons/linkedin.svg)](https://www.linkedin.com/company/merck-life-science) [![X icon](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/icons/x-icon.svg)](https://x.com/Merck_lifesci) [![Facebook Icon](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/icons/facebook.svg)](https://www.facebook.com/Merck.lifescience) [![Instagram Icon](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/icons/instagram.svg)](https://www.instagram.com/mercklifescience/) [![YouTube Icon](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/icons/youtube.svg)](https://www.youtube.com/@MerckLifeScience/featured) Merck __Výzkum. Vývoj.__ Jsme předním dodavatelem pro světový průmysl Life Science s řešeními a službami pro výzkum, vývoj a výrobu biotechnologií a vývoj a výrobu farmaceutických léčiv. [![Vibrant M string](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/icons/vibrant-m-string-1-rrvcrp.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs) [Sigma-Aldrich® Roztoky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/sigma-aldrich)[BioReliance® Řešení](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/bioreliance)[Millipore® Roztoky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/millipore)[SAFC® Řešení](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/safc)[Milli-Q® Roztoky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/milliq)[Supelco® Řešení](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/supelco) © 2026 Merck KGaA, Darmstadt, Německo a/nebo její pobočky. Všechna práva vyhrazena, včetně vytěžování textu a dat pro trénink umělé inteligence a podobných technologií. Reprodukce jakýchkoli materiálů z těchto stránek je bez povolení přísně zakázána. [Podmínky používání webu](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/legal/site-use-terms)|[Zásady ochrany osobních údajů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/legal/privacy-statement)|[Všeobecné podmínky prodeje](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/legal/terms-and-conditions)|[Souhlas s autorskými právy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/life-science/legal/copyright-consent)|[Mapa stránek](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/site-map)