[Přejít k obsahu](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs) Produkty Nákupní košík0 CZCS Produkty ProduktyAplikaceSlužbyZdrojePodpora [Přihlášení / Registrovat se](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Dohledání objednávky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/order-lookup) [Rychlá objednávka](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/quick-order) Nákupní košík0 [Domů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs)[Aplikace polymerázové řetězové reakce](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/applications/genomics/pcr)Standardní protokol pro PCR # Standardní protokol pro PCR ## Jak provést PCR Standardní postup polymerázové řetězové reakce (PCR) se skládá ze čtyř kroků: 1. Do zkumavek pro PCR přidejte potřebná činidla nebo mastermix a templát. 2. Promíchejte a odstřeďte. \*Přidejte minerální olej, aby se zabránilo odpařování v termocykléru bez vyhřívaného víka. 3. Proveďte amplifikaci podle parametrů termocykleru a primerů. 4. Vyhodnoťte amplifikovanou DNA pomocí elektroforézy na agarózovém gelu s následným obarvením ethidiumbromidem.  Tyto kroky jsou níže popsány podrobněji spolu s tipy pro výběr materiálů a reagencií. Jedná se o základní protokol PCR využívající Taq DNA polymerázu. ## Kroky PCR a základní komponenty PCR Řešení problémů s PCR reakcí zahrnuje mnoho faktorů. Podívejte se na tuto animaci a zjistěte, jak výběr správných komponent a podmínek cyklu podle vašich potřeb může pomoci dosáhnout optimálních výsledků. * * * Další protokoly pro jiné polymerázy nebo pokročilé techniky PCR najdete v sekci [„Protokoly“](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-technologies-protocols-introduction) naší příručky „PCR Technologies Guide“. Více informací o standardní PCR, včetně toho, co to vlastně je, najdete na naší [stránce Základy PCR](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/routine-amplification). ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Reagencie: Co je potřeba pro PCR? Reagencie používané při PCRDoporučený produkt   *Taq* DNA polymerázaVyberte *Taq* DNA polymerázu podle svých preferencí. (Viz samostatná [tabulka *Taq* polymeráz](https://www.sigmaaldrich.com#taqdnapolymerase) níže.) Voda pro PCRVoda pro PCR Primery zředěné na pracovní koncentraci Pro většinu testů postačují pracovní roztoky o koncentraci 10 µM. Oligonukleotidy[Oligonukleotidy na zakázku](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/molecular-biology-and-functional-genomics/oligos-and-qpcr-probes/custom-predesigned-dna-oligos-and-qpcr-probes) DNA určená k amplifikaciPoskytuje výzkumník Vyhrazené pipety  TermocyklérS bloky jamek různých velikostí nebo ve více formátech Sterilní filtrační špičky  Sterilní mikrocentrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml se šroubovacím uzávěremMikrocentrifugační zkumavky Corning® se šroubovacím uzávěrem PCR zkumavky nebo destičkyVyberte si podle typu cykléru:      Jednotlivé tenkostěnné 200 µL PCR zkumavky     200 µL zkumavky v pásu     Desky s více jamkami a těsnění desek Směs dNTPSměs deoxynukleotidů obsahující po 10 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP \*hotové směsi již obsahují dNTP ## Co je *Taq* polymeráza? *Taq* DNA polymeráza je termostabilní enzym pocházející z termofilní bakterie *Thermus aquaticus.* Běžně se používá k amplifikaci fragmentů DNA v PCR. Enzym je v rekombinantní formě, exprimovaný v *E. coli*. Je schopen odolat opakovanému zahřívání na 95 °C (jak to vyžaduje technika PCR) bez významné ztráty aktivity. Enzym má molekulovou hmotnost přibližně 94 kDa stanovenou metodou SDS-PAGE a nevykazuje žádnou detekovatelnou endonukleázovou ani exonukleázovou aktivitu. Má 5'→3' DNA polymerázovou aktivitu a 5'→3' exonukleázovou aktivitu. Každá šarže *Taq* DNA polymerázy je testována na amplifikaci pomocí PCR a sekvenování dvouvláknových molekul. Enzym se dodává v koncentraci 5 jednotek/µl a je vybaven optimalizovaným 10x reakčním pufrem. [](https://www.sigmaaldrich.com) ### Standardní *Taq* DNA polymeráza Pomocí níže uvedené tabulky vyberte vhodnou směs *Taq* DNA polymerázy pro vaše reakční podmínky. Vyberte si z čirých nebo červeně zbarvených přípravků s chloridem hořečnatým (MgCl₂) nebo bez něj, případně z předem připravených směsí typu „readymix“ nebo „master mix“ s pufrem a dNTP. Obsahuje MgCl₂             Oddělit MgCl₂Hotová směs                                        Čiré složení bez barvivaS červeným barvivem pro přímé nanášení na gelyČiré složení bez barvivaS červeným barvivem pro přímé nanášení na gelyČiré složení bez barviva *Taq* DNA polymeráza z *Thermus aquaticus* (D1806)*REDTaq®* DNA polymeráza (D4309)Taq DNA polymeráza z *Thermus aquaticus*, bez MgCl₂ (D4545)*REDTaq®* ReadyMix™ PCR reakční směs (R2523)ReadyMix™ *Taq* PCR reakční směs (P4600) __Definice jednotky:__ Jedna jednotka představuje začlenění 10 nmol celkových deoxyribonukleosidtrifosfátů do kyselinou srážitelné DNA za 30 minut při teplotě 74 °C. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Postup: Kroky PCR Optimální podmínky pro koncentraci *Taq* DNA polymerázy, templátové DNA, primerů a MgCl₂ závisí na použitém systému. Může být nutné stanovit optimální podmínky pro každou jednotlivou složku. To platí zejména pro *Taq* DNA polymerázu, parametry cyklů a koncentraci MgCl₂. Pro stanovení optimální účinnosti se doporučuje titrovat enzym a MgCl₂. 1. __Přidejte reagencie do zkumavky vhodné velikosti__ v pořadí uvedeném v tabulce. (Vyberte příslušnou tabulku pro přípravu reakce: standardní nebo hotová směs reagencií.) V případě velkého počtu reakcí je třeba připravit mastermix bez templátu a rozdělit jej do reakčních zkumavek. Na závěr je třeba do příslušných zkumavek přidat templát. ### Standardní PCR reakce ČástkaSložkaKonečná koncentrace w µLVoda  5 µl10x PCR pufr ([P2192](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/P2192) nebo [P2317](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/P2317))\*1x 1 µLSměs deoxynukleotidů200 µM w µLPřední primer (obvykle délka 15–30 bází)0,1–0,5 µM x µL Zpětný primer (obvykle o délce 15–30 bází) 0,1–0,5 µM 0,5 µL *Taq* DNA polymeráza* 0,05 jednotek/µL y µL Šablonová DNA (obvykle 10 ng) 200 pg/µl z µL 25 mM MgCl₂ (používejte pouze s pufrem [P2317](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/P2317)) 0,1–0,5 mM __50 µL__ __Celkový objem__ __reakce__ \*Kupte si pufr a *Taq* polymerázu v jednom balení: D1806, D4309 nebo D4545 ### Hotová směs pro PCR reakci ČástkaSložkaKonečná koncentrace 25 µL Readymix ([R2523](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/R2523) nebo [P4600](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/P4600))   w µL Primér vpřed (obvykle délka 15–30 bází) 0,1–0,5 µM x µL Zpětný primer (obvykle o délce 15–30 bází) 0,1–0,5 µM y µL Šablonová DNA (obvykle 10 ng) 200 pg/µL z µL Voda   __50 µL__ __Celkový objem reakce__ 2\. __Jemně promíchejte pomocí vortexu a krátce odstřeďte,__ aby se všechny složky usadily na dně zkumavky. Poznámka: Pokud používáte termocyklér bez vyhřívaného víka, přidejte do horní části každé zkumavky 50 µL minerálního oleje, aby se zabránilo odpařování. 3\. __Proveďte amplifikaci.__ Parametry amplifikace se budou lišit v závislosti na použitých primerech a termocykleru. Může být nutné optimalizovat systém pro jednotlivé primery, templát a termocykler. ### Typické parametry cyklů Doporučuje se 25–30 amplifikačních cyklů. | | | | |---------------------|------------|-------------| | Krok PCR | Teplota °C | Doba trvání | | Denaturace templátu | 94 °C | 1 min | | Anelace primerů | 55 °C | 2 min | | Extenze | 72 °C | 3 min | 4\. __Amplifikovanou DNA lze vyhodnotit pomocí [elektroforézy na agarózovém gelu](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/nucleic-acid-gel-electrophoresis/nucleic-acid-electrophoresis) a následného obarvení ethidiumbromidem.__       Poznámka: Vrstvu minerálního oleje lze odstranit jednou extrakcí chloroformem (v poměru 1:1) a získat tak vodnou fázi. ### [](https://www.sigmaaldrich.com)Reagencie pro elektroforézu nukleových kyselin - Agaróza (předem připravené gely, prášek atd.) - Pufr, např. MOPS-EDTA-octan sodný, tris-acetát-EDTA (TAE) nebo tris-borát-EDTA (TBE) - Roztok pro nanášení do gelu a pufr pro nanášení vzorků pro RNA - Barvivo pro elektroforézu, např. ethidiumbromid 1\. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. [https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695](https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695) 2\. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. [https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371](https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371) 3\. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press. 4\. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press. 5\. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. [https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436](https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436) 6\. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell. 7\. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. [https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989](https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989) 8\. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. [https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775](https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775) 9\. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press. 10\. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 11\. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. [https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465](https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465) 12\. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. [https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266](https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266) ## Prohlášení o licenci k štítku ### UPOZORNĚNÍ PRO KUPUJÍCÍHO: VYLOUČENÍ LICENCE Zakoupením tohoto produktu se neuděluje žádná licence na základě žádného z amerických patentů č. 5 804 375, 5 994 056, 6 171 785, 6 214 979, 5 538 848, 5 723 591, 5 876 930, 6 030 787 a 6 258 569 ani na základě odpovídajících patentů mimo území Spojených států, ani na základě jakýchkoli jiných patentů nebo patentových přihlášek týkajících se procesů 5'-nukleázy a barviv vázajících dsDNA. Další informace získáte u ředitele pro licencování společnosti Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, Kalifornie 94404, USA ## Materiály Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba. Response not successful: Received status code 500 __Související články__ - [Instalace a použití systémů pro čištění vody Milli-Q® SQ *2Series*](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/wet-chemical-analysis/installation-use-of-milli-q-2series-water-purification-system) - [Optimalizovaná detekce mykoplazmy pomocí PCR](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-counting-and-health-analysis/optimized-pcr-based-mycoplasma-detection) - [Výběr rekombinantů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/cloning-and-expression/restriction-enzyme-cloning-manual-recombinants) - [Protokol extrakce DNA z bukální sliznice a amplifikace WGA](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/extraction-protocol-buccal-swab) - [Protokol žíhání oligonukleotidů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/pcr/annealing-oligos) - [Protokol PCR s koncovým bodem pro dlouhou a přesnou amplifikaci DNA](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/pcr/long-and-accurate-dna-amplification) - [Protokol pro konjugaci NHS-esterových modifikací s aminoznačenými oligonukleotidy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/pcr/nhs-ester-oligonucleotide-conjugation) - [Teplota tání oligonukleotidů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/pcr/oligos-melting-temp) - [Zobrazit více](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Související kategorie produktů__ - [Těsnicí fólie, fólie a pásky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [GC analýza 37složkové směsi FAME na přístroji SP™-2560](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/c-analysis-of-a-37-component-fame-mix) - [Kapilární GC kolona MET-Biodiesel](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/gc-columns) - [Brom v pitné vodě, vodě z bazénů, odpadních vodách a dezinfekčních roztocích](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry/bromine-in-drinking-water) - [Poznámky k použití: Reflektometrie - Hydroxymethylfurfural (HMF) v medu](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry/hmf-in-honey) - [Strategie vývoje chirálních metod pro HPLC](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/chiral-method-development) - [Rychlá a přesná LC-MS analýza metabolitů vitaminu D pomocí HPLC kolon Ascentis® Express F5](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/fast-and-accurate-lc-ms-analysis) - [Hmotnostní spektrální vypuštění kolony ve stacionárních fázích HPLC s obsahem dusíku v polární vrstvě](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/mass-spectral-column) - [Zobrazit více](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) Nejvyšší __Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.__ Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet. Přihlásit__Nemáte účet?__Registrovat Toto je strojově přeložená stránka. An unknown error has occured.