[Přejít k obsahu](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs) Produkty Nákupní košík0 CZCS Produkty ProduktyAplikaceSlužbyZdrojePodpora [Přihlášení / Registrovat se](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Dohledání objednávky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/order-lookup) [Rychlá objednávka](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/quick-order) Nákupní košík0 [Domů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs)[qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/applications/genomics/qpcr)Protokol pro stanovení účinnosti qPCR # Protokol pro stanovení účinnosti qPCR ### Přečtěte si o tom - [Optimalizace podmínek qPCR](https://www.sigmaaldrich.com#optimization) - [Vybavení](https://www.sigmaaldrich.com#vybaven%C3%AD) - [.Reagencie](https://www.sigmaaldrich.com#reagenty) - [Supplies](https://www.sigmaaldrich.com#supplies) - [Metody](https://www.sigmaaldrich.com#metody) - [Související produkty](https://www.sigmaaldrich.com#produkty) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Optimalizace podmínek qPCR Optimalizace podmínek qPCR je důležitá pro vývoj robustního testu. Indikací špatné optimalizace je nedostatečná reprodukovatelnost mezi replikáty a také neúčinné a necitlivé testy. Dva hlavní přístupy jsou optimalizace koncentrace primerů a/nebo teploty žíhání. Po optimalizaci testu je důležité ověřit účinnost reakce. Tato informace je důležitá při podávání zpráv a porovnávání testů. V tomto ukázkovém protokolu je účinnost testu porovnávána v širokém a úzkém dynamickém rozsahu koncentrací cDNA. V praxi je běžné zvolit k testování jeden rozsah v závislosti na očekávaném rozsahu cílových hodnot ve vzorcích, takže uvedený protokol lze upravit podle požadavků experimentu. V tomto příkladu je účinnost vypočtena s použitím 10násobné i 2násobné řady ředění. Standardní křivka by měla zahrnovat očekávaný rozsah exprese pro geny zájmu Všimněte si, že proporcionalita výtěžnosti cDNA vzhledem ke vstupní RNA je při použití ReadyScript® lineární;RT kit, takže tento experiment lze přizpůsobit RT-qPCR, pokud se používá tento systém, a to tak, že se 1) naředí RNA a provedou reakce RT a 2) poté se provede qPCR na každém z výsledných vzorků cDNA (viz [Reverzní transkripce](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/reverse-transcription) pro příklady). Toto však neplatí vždy a neplatí to pro všechny soupravy nebo protokoly reverzní transkripce. To je třeba ověřit před přizpůsobením tohoto protokolu alternativní soupravě  ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Vybavení - Přístroj pro kvantitativní PCR__/li>__ - __Kryt s laminárním průtokem pro nastavení PCR (volitelný)__ ____[](https://www.sigmaaldrich.com)Reagenty____ __DNA, která se použije jako šablona standardní křivky (např.g., cDNA, gDNA nebo syntetická šablona). KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ ([KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/KCQS00)__ __Voda třídyPCR: PCR grade water ([W1754](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/W1754) nebo [W4502](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/W4502)) jako 20 ml alikvotů; zmrazit; pro každou reakci použít čerstvý alikvot. Přední a zpětné primery pro testované geny (zásoba 10 μM).__  Hot Start ReadyMixes (Taq, pufr, dNTPs, referenční barvivo, MgCl2) KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ ([Kat. No. KCQS00](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/KCQS00))KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox ([Kat. No. KCQS01](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/KCQS01))KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ s ROX ([Kat. No. KCQS02](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/KCQS02))KiCqStart® SYBR.® Green qPCR ReadyMix™ for iQ ([Kat. No. KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/KCQS03)) __Kompatibilní přístroje: KCQS03, KCQS03, KCQS03, KCQS03:____Kompatibilní přístroje:____Kompatibilní přístroje:____Kompatibilní přístroje:__ Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™Rychlý Applied Biosystems ViiA 7Bio-Rad MiniOpticon™Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700 Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900 Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™ Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™ Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q Roche LightCycler® 480 Tabulka 1.Průvodce výběrem zelené směsi SYBR® PCR Mix™. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Supplies - Sterilní filtr [hroty pro pipety](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [Sterilní 1.Mikrozkumavky se šroubovacím uzávěrem o objemu 5 ml (CLS430909)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/CLS430909) - Zkumavky a destičky pro PCR, vyberte si takovou, která odpovídá požadovanému formátu: \-    Jednotlivé tenkostěnné 200 μl PCR zkumavky ([Z374873](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/Z374873)) \-    Destičky       - [96jamkové destičky (Z374903)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/Z374903)       - [Destičky s 96 jamkami.Destičky s 384 jamkami (Z374911)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/Z374911) \-    Těsnění destiček       - [Těsnicí fólie ThermalSeal RTS™ (Z734438)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/Z734438)       - [ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/Z722553) ### Poznámky k tomuto protokolu - CDNA se vytváří pomocí náhodného primingu nebo metody oligo-dT (viz [Standardní protokol reverzní transkripce (dvoukrokový)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-reverse-transcription-protocol-two-step)). Produkt RT se naředí pro přípravu standardních křivek (jako příklad jsou uvedeny křivky 1:2 a 1:10). RNA lze také naředit a z každého ředění syntetizovat cDNA pomocí soupravy ReadyScript® nebo lze použít jednokrokový postup RT-qPCR naředěním RNA a dodržením jednokrokového postupu RT-qPCR v Protokolu reverzní transkripce (jednokrokový SYBR® Green I Dye Detection) a [Protokol reverzní transkripce (jednostupňová detekce sondy)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/pcr/reverse-transcription-one-step-probe-detection). Alternativně lze nahradit templáty DNA tak, aby očekávaný rozsah Cq byl v rozmezí Cq 15 až Cq 38. - Každá koncentrace sériového ředění bude probíhat jako duplicitní reakce. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Metoda 1\.      Připravte qPCR master mix, který postačí na 40 reakcí podle __Tabulky 2__. To umožňuje navíc       zohlednit chyby pipetování, protože bude probíhat 32 reakcí (__Tabulka 3__). ReagencieObjem (μl) pro 40 reakcí 2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™.10400 Přední primer (10 μM)0.936 Reverzní primer (10 μM)0.936 Voda pro PCR3,2128 Tabulka 2.Reakční směs pro vytvoření standardní křivky 1:2 a 1:10. 2.    DNA nařeďte v sériích 1:10 a 1:2, přičemž každá série zahrnuje 7 bodů ředění (__Tabulka 3__, Rozložení destiček pro ředění DNA). 3\.     Do definovaných jamek přidejte 5 μl příslušného ředění templátu (__Tabulka 3__, Rozložení destiček pro ředění DNA). Rozložení destiček pro ředění DNA Destička Sloupec1234Zbytek destičky A1111 B0.10,10,50,5 C0.010,010,250,25 D0.0010,0010,1250.125 E0,00010,00010.06250,0625 F0.000010,000010,031250.03125 G0.0000010.0000010.0156250.015625 HNTCNTC<./td> NTCNTC Tabulka 3. Schéma prvních čtyř sloupců 96jamkového uspořádání destiček s vyznačením umístění ředění šablon standardních křivek. Uvedené ředění je vztaženo k původnímu základnímu roztoku. Při použití umělé šablony je možné vypočítat počet kopií (vzhledem k hodnotám OD). 4.    Do každé jamky přidejte 15 μl master mixu (__Tabulka 3__). 5.    Uzavřete zkumavky nebo uzavřete desku a označte ji. (Ujistěte se, že označení nezakrývá excitaci/detekci přístroje      dráhu světla). 6.     Spusťte vzorky podle níže uvedeného dvoukrokového protokolu. Kroky 1-2 se opakují po 40 cyklech. Následuje        amplifikace s analýzou standardní disociační křivky. | | | | |-------------------------------------------|--------------|---------| | Cyklické podmínky | Teplota (°C) | Čas (s) | | Počáteční denaturace/Horký start | 95 | 30 | | __Kroky 1 až 2 se opakují po 40 cyklech__ | | | | Krok 1 | 95 | 5 | | Krok 2 | 60 | 30 | Tabulka 4.Podmínky cyklování PCR pro generování standardní křivky. *__Poznámka:__* Použijte standardní protokol disociační křivky (sběr dat). ## Související produkty Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba. Response not successful: Received status code 500 __Související články__ - [Návrh testu PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) - [Optimalizace a validace testu PCR](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) - [Syntéza oligonukleotidů DNA](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/dna-oligonucleotide-synthesis) - [Uzamčená nukleová kyselina a pojivo pro menší drážky / zhášeč tmy Eclipse](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/locked-nucleic-acids-faq) - [Kvantifikace oligonukleotidů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/quantitation-of-oligos) - [Řešení problémů s RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting) - [Řešení problémů s amplifikací PCR a RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting-pcr-and-rt-pcr-amplification) - [ZHÁŠEČ ČERNÝCH DĚR™ (BHQ™)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/black-hole-quenchers) - [Zobrazit více](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Související kategorie výrobků__ - [Těsnicí fólie, fólie a pásky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Hroty pipet](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [Oligonukleotidy a sondy pro qPCR na míru](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/molecular-biology-and-functional-genomics/oligos-and-qpcr-probes/custom-predesigned-dna-oligos-and-qpcr-probes) - [Oligos, sondy qPCR a peptidy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/molecular-biology-and-functional-genomics/oligos-and-qpcr-probes) Nejvyšší __Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.__ Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet. Přihlásit__Nemáte účet?__Registrovat Toto je strojově přeložená stránka. An unknown error has occured.