Často kladené otázky ke kultuře organoidů

• Co jsou to organoidy?
• Co je to organoidní biobanka?
• Jaký je rozdíl mezi organoidy a sféroidy?
• Jak se organoidy generují?
• Jaké jsou výhody/nevýhody iPSC vs PDO?
• Jak se nádorové organoidy používají ve výzkumu rakoviny?
• Jak se organoidy kultivují?
• Je pro kultivaci organoidů nutný matrigel?
• Co jsou to matrigelové domely?
• Jak odstranit Matrigel z organoidních kultur?
• Jaká média nebo doplňky jsou pro organoidy potřeba?
• Jak dlouho lze organoidy v kultuře expandovat?
• Jak provádíte pasáž organoidů?
• Můžete organoidy zmrazit nebo kryokonzervovat?
• Jak obarvíte organoidy protilátkami?
• Jak extrahujete RNA/DNA z organoidů kultivovaných v Matrigelu?
• Jsou pro organoidy nutné specializované testy?
• Jak provádíte test buněčné toxicity s použitím organoidů?
• Jak snižujete variabilitu u organoidních kultur?
• Kde lze zakoupit lidské organoidy z etických zdrojů?

Co jsou organoidy?

Organoidy jsou komplexní, mnohobuněčné trojrozměrné in vitro buněčné modely používané v biomedicínském výzkumu, které věrně napodobují in vivo orgány. Hans Clevers, průkopník organoidní biologie v Hubrechtově institutu, v roce 2009 poprvé prokázal, že jediná střevní kmenová buňka exprimující LGR5⁺ se dokáže samoorganizovat do krypto-villusových struktur podobných dospělému střevu. Od té doby byly organoidy odvozeny z mnoha tkání, mimo jiné z mozku, tlustého střeva, ledvin, jater, slinivky, plic a nádorových biopsií.

Obrázek 1a. Myší střevní organoid.

Obrázek 1b. Organoidy lidského tlustého střeva.

Obrázek 1c. Lidské plicní organoidy.

Co je to organoidní biobanka?

Pro personalizované aplikace v lékařském výzkumu byly vytvořeny biobanky lidských organoidů z různých tkání, které obsahují širokou škálu buněčných a molekulárních fenotypů. Například vytvoření sbírky normálních a nemocných gastrointestinální organoidy pomohly při výzkumu rakoviny tlustého střeva a dalších onemocnění souvisejících s trávicím traktem, jako je Crohnova choroba, syndrom dráždivého tračníku (IBS) a ulcerózní kolitida.

Obrázek 2. Izolace a kryokonzervace organoidů odvozených od pacientů (PDO) může být použita k vytvoření organoidních biobank.

Jaký je rozdíl mezi organoidy a sféroidy?

Organoidy

Sféroidy

• Získané z kmenových buněk nebo primární tkáně
• Více typů buněk s komplexní strukturou
• Kultivované v hydrogelu (Matrigel)
• Vysoký fyziologický význam pro screening léčiv
• Neomezená životnost

• Odvozeno z imortalizovaných buněčných linií
• Jednotný typ buněk s jednoduchou strukturou
• Kultivováno jako volně plovoucí agregáty na destičkách s nízkou adhezí
• Menší fyziologický význam (tj.např. gradient hypoxie)
• Omezená životnost

Jak se generují organoidy?

Organoidy lze získat buď z dospělé tkáně, označované jako organoidy odvozené od pacienta (PDO), nebo z pluripotentních kmenových buněk (lidských ES/iPSC). Izolace a expanze populace kmenových buněk LGR5⁺ je rozhodující pro zachování schopnosti sebeobnovy organoidů. Mezi další kritické faktory pro udržení organoidů v kultuře patří používání matrigela GFR s kvalifikovanou šarží, dodržování správných technik pasážování a získávání vysoce kvalitních organoidních médií a činidel pro kultivaci buněk.

Protokoly kultivace organoidů

• In Vitro./i> Diferenciace lidských iPS buněk na organoidy tlustého střeva
• In Vitro Diferenciace lidských iPS buněk na plicní epitelové organoidy dýchacích cest
• Imnofluorescenční barvení celkových organoidů pomocí protilátek
• Forskolinem indukované testy otoků

Jaké jsou výhody/nevýhody iPSC oproti PDO?
Popis	Organoid Type
	PDO	iPSC
Kratší doba pro vytvoření organoidů	X
Více reprezentativní pro zralé tkáně	X
Složitější buněčná heterogenita	X
Větší genetická rozmanitost (možnost biobanky)	X
Více reprezentativní pro specifický stav onemocnění pacienta	X
Možnost generovat více typů buněk ze stejného genetického pozadí		X
Snadnější získávání materiálu		X
Snadnější provádění genových úprav		X

Jak se nádorové organoidy používají ve výzkumu rakoviny?

Organoidy odvozené od pacientů lze vytvořit z biopsie zdravé i nádorové tkáně. Bylo prokázáno, že nádorové organoidy (tumoroidy) si zachovávají klíčové genetické a fenotypové charakteristiky své původní tkáně a podtypu nádoru při zachování vnitronádorové heterogenity. Nedávno byly nádorové PDOs použity jako in vitro prediktor odpovědi na chemoterapeutickou léčbu, což ukazuje význam těchto modelů při identifikaci nových protinádorových léčebných postupů prostřednictvím screeningu léčiv. 

Obrázek 3. Screening léčiv pomocí organoidů 3dGRO™ Lidský kolorektální karcinom (CRC). (A) CRC organoidy byly rozmraženy a ponechány k zotavení po dobu 48 hodin, po níž následovala titrace trametinibu spolu s kontrolní dávkou DMSO po dobu 5 dnů. Organoidy byly poté obarveny na jaderné (modře) a cytoskeletální (červeně) markery pro konfokální zobrazení. (B) Životaschopnost organoidů v koncovém bodě testu byla stanovena pomocí CellTiter-Glo^® 3D, aby bylo možné vytvořit titrační křivky a hodnoty IC50. Měřítka: 100 μm. CRC-A: ISO50 (SCC504),CRC-B: CRC-C: ISO72 (SCC506), CRC-C: ISO72 (SCC507).

Jak se kultivují organoidy?

Po izolaci se organoidy kultivují ve specializovaných médiích vložených do hydrogelu s bohatým extraktem extracelulární matrix (ECM) bazální membrány, jako je Matrigel se sníženým obsahem růstových faktorů. Médium se doplňuje každý druhý den a buňky se pasážují jednou týdně (7-12 dní), než se buňky příliš zvětší nebo nekrotizují. Buňky lze pasážovat buď v malých shlucích, nebo jako jednotlivé buňky pomocí mechanické disociace/bezenzymových pasážovacích činidel. V závislosti na typu organoidu a konfluenci lze při pasážování organoidů použít poměry dělení zhruba 1:3-1:4. U citlivých typů organoidů lze během pasážování přidat ROCKi (Y27632) (SCM075), který pomáhá při podpoře životaschopnosti buněk.

Průvodce protokolem PDO pro gastrointestinální organoidy

Je pro kultivaci organoidů nutný matrigel?

Ano, Matrigel je nezbytný pro podporu správného růstu organoidů. Matrice Matrigel poskytuje nezbytné chemické signální cytokiny a strukturální proteiny ECM potřebné k napodobení přirozeného in vivo 3D prostředí. Matrigel se často používá v neředěném formátu (8 mg/ml nebo více) k vytvoření Matrigelových kopulí používaných ke kultivaci organoidů. V poslední době se suspenzní kultury organoidů s vyšší propustností vytvářejí přidáváním zředěného matrigela do média spíše než využitím matrigelových kopulí.

Co jsou matrigelové kopule?

Komolová metoda pěstování organoidů zahrnuje nasazení fragmentů organoidů do jedné kapky Matrigelu ECM a umožnění polymerace. Jakmile Matrigel ECM polymeruje, přidá se médium do jamky na vrcholu kopule. Do každé jamky se obvykle nasadí jedna kopulka Matrigelu.

Obrázek 4. Technika kultivace organoidů s kopulí z matrigela.

 

Jak odstranit matrigel z organoidních kultur?

Matrigel lze odstranit během pasážování odstředěním při 1100 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Po odstředění lze opatrně odsát tenkou vrstvu matrigelu viditelnou nad peletou organoidních buněk. Organoidy by se měly propláchnout médiem nebo PBS a znovu odstředit, aby se odstranil další matrigel. K obnově organoidů z kopulí Matrigelu lze navíc použít roztok pro obnovu buněk společnosti Corning^®.

Jaká média nebo doplňky jsou pro organoidy potřeba?

Každý typ organoidních buněk vyžaduje jedinečnou sadu bezsérových médií. Mezi běžně používaná média a doplňky patří pokročilý DMEM/F12 (SCM162), N-2 (SCM012), N-27 (SCM013), niacinamid, N-acetyl-L-cystein, gastrin WNTs, R-Spondin-1, Noggin, FGFs, EGFs nebo inhibitory malých molekul, jako jsou CHIR99021, SB202190 a A-83-01.

Aby se snížily náklady na drahé rekombinantní proteiny, byly v rámci projektu L-WRN (WNT, R-Spondin, Noggin) (SCM105), R-Spondin-1 (SCM104) a kondicionovaná média WNT byly použity jako levná alternativa rekombinantních proteinů k doplnění organoidních médií.

Jak dlouho lze organoidy v kultuře rozšiřovat?

Většinu organoidů lze rozšiřovat neomezeně dlouho, pokud je populace kmenových buněk LGR5⁺ udržována pomocí vhodných médií a technik pasážování. Doporučuje se provádět expresi markerů a analýzu karyotypu každých 5-10 pasáží, aby byla zajištěna kvalita a identita organoidů.

Jak pasážovat organoidy?

Organoidy lze pasážovat buď v malých shlucích fragmentů, nebo v jednotlivých buňkách pomocí mechanické disociace nebo bezenzymových pasážovacích činidel.

Můžete organoidy zmrazit nebo kryokonzervovat?

Ano. V závislosti na typu organoidních buněk lze ke kryokonzervaci organoidů použít optimalizované médium pro zmrazování organoidních buněk (SCM301). Kryokonzervovat lze mnoho typů organoidů odvozených od pacienta. Některé typy zralých organoidních buněk odvozených z iPSC, jako jsou plicní organoidy, však nelze úspěšně zmrazit. Organoidy by měly být před zmrazením předem ošetřeny přípravkem ROCKi (Y27632) (SCM075), aby se podpořila životaschopnost buněk. Doporučujeme zmrazit 5-10 Matrigelových kopulí do 1 kryovialky pomocí kontrolované Mr. Frosty mrazicí nádoby. Průměrná hustota organoidů v každé kopuli by měla být v době zmrazení ~90 %, aby byla zajištěna co nejvyšší životaschopnost buněk.

Jak obarvit organoidy protilátkami?

Organoidy lze barvit protilátkami pro imunocytochemickou (ICC)/imunohistochemickou (IHC) analýzu buď technikou whole-mount, nebo technikou zalití do parafínu/řezu. Je velmi důležité používat protilátky předem kvalifikované pro analýzu organoidů.

Průvodce protokolem: Imunofluorescenční barvení celých organoidů pomocí protilátek

Střevní organoidy

Plicní organoidy

Obrázek 5. Barvení organoidů protilátkami. Colon a plicní organoidy obarvené protilátkami souvisejícími se SARS-Cov2 (ACE2 a TMPRSS2).

Jak extrahovat RNA/DNA z organoidů kultivovaných v matrigelech?

Tradiční Sady pro izolaci DNA/RNA lze použít k přípravě genomového materiálu pro sekvenování (RNA-seq, scRNA-seq, WGS, CHIP-seq atd.). Pro některé aplikace s velkými organoidy se doporučují soupravy pro extrakci DNA/RNA specifické pro danou tkáň. Reagencie TRI (T9424) může být přidána k disociovaným organoidům před extrakcí RNA a může být skladována při -80 °C až do budoucího použití.

Jsou pro organoidy nutné specializované testy?

Vzhledem k proměnlivé povaze organoidů vyžaduje většina tradičních testů další experimentální optimalizaci. Například běžný test životaschopnosti živých mrtvých buněk (CBA415) byl optimalizován pro 3D kultury včetně organoidů. Test se opírá o Calcein-AM (živé buňky), Propidium Jodid (mrtvé buňky) a Hoechst 33342 (všechny buňky). Dalším běžným testem na organoidech je Forskolinem indukovaný test bobtnání organoidů, který měří funkci CFTR.

Obrázek 6. Lidské organoidy tlustého střeva odvozené z iPSC obarvené pomocí soupravy pro testování životaschopnosti živých a mrtvých buněk. Horní řada ukazuje živé kultury obarvené kalceinem-AM (A), propidiumjodidem (B), Hoechstem 33342 (C) a sloučený snímek v jasném poli (D). Na spodním panelu snímků (E-H) jsou organoidy fixované 70% etanolem a poté obarvené kalceinem-AM (E)./b>, propidium jodidem (F), Hoechstem 33342 (G) a sloučený snímek v jasném poli (H).

Jak provést test buněčné toxicity pomocí organoidů?

Pro analýzu cytotoxických účinků sloučenin léčiv se používají testy na bázi luciferázy, které měří ATP, jako je například test buněčné životaschopnosti na bázi luciferázy (Cell Viability Luciferase Assay, SCT149) nebo CellTiter-Glo^® 3D Cell Viability Assays se často používají na organoidních kulturách.

Protokol pro screening léčiv na organoidech

Obrázek 7. Testování cytotoxicity flavopiridolu pomocí organoidů lidského tlustého střeva. 100 µM flavopiridolu způsobuje cytotoxické účinky na lidské organoidy tlustého střeva analyzované pomocí testu 3D buněčné životaschopnosti CellTiter-Glo^®.

Jak snížit variabilitu v organoidních kulturách?

Některé typy organoidních buněk, například lidské organoidy tlustého střeva, lze pasážovat po jednotlivých buňkách pomocí disociačních činidel TrypLE Express. Nasazení ekvivalentního počtu organoidů na jamku vytváří rovnoměrnější organoidní kultury než tradiční mechanické nebo enzymatické techniky pasážování shluků. Při pasážování jednotlivých buněk je pro zachování životaschopnosti buněk rozhodující přidat do média ROCKi Y27632 (SCM075) v konečné koncentraci 10 μM. Další technikou pro snížení variability testu je ruční odstranění organoidů s abnormální morfologií při zachování organoidů podobných velikostí.

Kde lze zakoupit lidské organoidy z etických zdrojů?

Nabízíme sbírky vysoce kvalitních gastrointestinální PDO, jakož i iPSC odvozené Colon a Lung organoidy.

Související produkty

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Response not successful: Received status code 500