[Přejít k obsahu](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs) Produkty Nákupní košík0 CZCS Produkty ProduktyAplikaceSlužbyZdrojePodpora [Přihlášení / Registrovat se](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Dohledání objednávky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/order-lookup) [Rychlá objednávka](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/quick-order) Nákupní košík0 [Domů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs)[Klonování a exprese](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/applications/genomics/cloning-and-expression)Modrobílý screening a protokoly pro výběr kolonií # Modrobílý screening a protokoly pro výběr kolonií ## Identifikace rekombinantních bakterií Blue-white screening je rychlá a účinná technika identifikace rekombinantních bakterií. Spoléhá na aktivitu β-galaktosidázy, enzymu vyskytujícího se v *E. coli*, který štěpí laktózu na glukózu a galaktózu. ## Narušení genu LacZ Přítomnost laktózy v okolním prostředí spouští v *E. coli* operon lacZ. Aktivita operonu vede k produkci enzymu β-galaktoisdázy, který metabolizuje laktózu. Většina plazmidových vektorů nese krátký úsek genu lacZ, který obsahuje kódovací informaci pro prvních 146 aminokyselin β-galaktozidázy. Použité hostitelské *E. coli* kmeny jsou kompetentní buňky obsahující deleční mutaci lacZΔM15. Když jsou tyto buňky schopny přijmout plazmidový vektor, vzniká díky procesu α-komplementace funkční enzym β-galatosidáza. Plazmidové vektory používané při klonování jsou manipulovány tak, aby tento proces α-komplementace sloužil jako marker rekombinace. V rámci sekvence lacZ v plazmidovém vektoru je přítomno vícenásobné klonovací místo (MCS). Tuto sekvenci lze proříznout restrikčními enzymy a vložit tak cizí DNA. Když je plazmidový vektor obsahující cizí DNA přijat hostitelskou *E. coli*, nedojde k α-komplementaci, a proto se nevytvoří funkční enzym β-galaktosidáza. Pokud není cizí DNA do vektoru vložena nebo pokud je vložena na jiném místě než MCS, gen lacZ v plazmidovém vektoru doplňuje deleční mutaci lacZ v hostitelské *E. coli* produkující funkční enzym. ## Jak funguje screening modrobílé barvy? Pro screening klonů obsahujících rekombinantní DNA se na agarovou plotnu přidává chromogenní substrát známý jako X-gal. Pokud se vytvoří β-galaktosidáza, X-gal se hydrolyzuje za vzniku 5-brom-4-chlorindoxylu, který spontánně dimerizuje za vzniku nerozpustného modrého pigmentu zvaného 5,5'-dibromo-4,4'-dichlorindigo. Kolonie vytvořené nerekombinovanými buňkami se proto jeví jako modré, zatímco rekombinované buňky se jeví jako bílé. Požadované rekombinantní kolonie lze snadno vybrat a kultivovat. Isopropyl β-D-1-thiogalaktopyranosid (IPTG) se používá spolu s X-galem pro modrobílý screening. IPTG je nemetabolizovatelný analog galaktózy, který indukuje expresi genu lacZ. Je třeba poznamenat, že IPTG není substrátem pro β-galaktosidázu, ale pouze induktorem. Pro účely vizuálního screeningu je zapotřebí chromogenní substrát, jako je X-gal.  __Obrázek 1.__Schematické znázornění typického plazmidového vektoru, který lze použít pro modrobílý screening.  __Obrázek 2.__Schematické znázornění typického postupu modrobílého screeningu. ## Modrobílé stínící výrobky (materiály) Výrobek č.NázevRozpustnostAkcePoužitíSpeciální vlastnosti [B6650](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B6650)[X-GlcA](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B6650)DMFPřístroj pro výrobu a distribuci potravin a nápojůSubstrát pro ß-galaktosidázu a ß-glukuronidázuskríning genové detekce rekombinantních bakterií - screening modrobílé barvy [X-GalNAc](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/16658)DMF, DMSOSubstrát pro N-acetyl-ß-galaktosidázuscreening rekombinantních bakterií a *Candida albicans* - screening modrobílé S7313[S-Gal<.sup>® sodná sůl](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/S7313)VodaSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning genové detekce rekombinantních bakterií - modrobílý screening - autoklávovatelný - zvýšený kontrast pro automatické počítání kolonií [S9811](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/S9811)[S-Gal®](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/S9811)VodaSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning rekombinantních bakterií - modrobílý screening - autoklávovatelný - zvýšený kontrast pro automatické počítání kolonií [C4478](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/C4478)[S-Gal®/LB Agar Blend](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/C4478)VodaSubstrát pro ß-galaktosidázuscreening rekombinantních bakterií - modrobílý screening - autoklávovatelný - zvýšený kontrast pro automatické počítání kolonií má přidaný IPTG [B2904](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B2904)[Bluo-Gal](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B2904)DMFSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning rekombinantních bakterií - modrobílý skríning screening/li> nevyžaduje sterilizaci B3928[Blue-White Select™ Screening Reagent](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/produkt/sigma/B3928)Roztok připravený k použitíSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning rekombinantních bakterií - modrobílý screening [16669](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/16669)[Magenta-Gal](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B8931).DMF, DMSOSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning rekombinantních bakterií - skríning červenobílých [B8931](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B8931)[Magenta-Gal](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/16669)MethanolSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning rekombinantních bakterií - červenobílý skríning [B4252](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/b4252)[5-bromo-4-chlor-3-indolyl ß-D-galaktopyranosid](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/b4252)DMF, DMSOSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning rekombinantních bakterií - modrobílý skríning - může být použit pro imunocytochemii - může být použit pro imunocytochemii - není nutná sterilizace a href="/CZ/cs/product/sigma/B9146">B9146[5-Bromo-4-chlor-3-indolyl ß-D-galaktopyranosid](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B9146)DMF, DMSOSubstrát pro ß-galactosidasescreening of recombinant bacteria - blue-white screening - není nutná sterilizace B6024[5-Bromo-4-chlor-3-indolyl ß-D-galaktopyranosid (tableta)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B6024)DMF, DMSOPodrobný popis produktuSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning rekombinantních bakterií - screening modrobílé - není nutná sterilizace [16665](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/16665)[5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galaktopyranosid](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/16665)DMF, DMSOPodrobný popisSubstrát pro ß-galaktosidázuskríning rekombinantních bakterií - modrobílý screening - není nutná sterilizace [I1284](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/I1284)[Roztok isopropyl ß-D-thiogalaktopyranosidu](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/I1284)Roztok připravený k použitíIndukuje promotor LacScreening rekombinantních bakterií - screening modrobílé barvy - může být přidán do kultivačního média [I6758](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/i6758)[Isopropyl ß-D-1-thiogalaktopyranosid](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/i6758)VodaIndukuje Lac promotorScreening rekombinantních bakterií - modrobílý screening [I5502](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/i5502)[Isopropyl ß-D-1-thiogalaktopyranosid](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/i5502)VodaIndukuje promotor LacScreening rekombinantních bakterií - screening modrobílé ## Protokoly pro modrobílý screening Kompletní protokol modrobílého screeningu zahrnuje 3 důležité kroky: - Ligace: ligace cizí DNA do MCS plazmidového vektoru - Transformace: zavedení plazmidového vektoru s vloženou cizí DNA do kompetentního *E. coli* - Screening: modrobílý screening k identifikaci rekombinantních bakteriálních kolonií ### Ligace Nabízíme následující expresní vektory připravené k použití, které lze použít pro stabilní i přechodné expresní systémy. Tyto FLAG-fúzní konstrukty mají počátky replikace pro množení v bakteriálních i savčích buňkách. | | | | |-----------------------------------------------------------------|-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|-----------------------| | Výrobek č. | Název | Kompatibilita | | [E6783](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E6783) | [pFLAG-CMV™-3 expresní vektor](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E6783) | Bakterie, savčí buňky | | [E7658](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E7658) | [p3XFLAG-CMV™-10 expresní vektor](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E7658) | Bakterie, savčí buňky | | [E7283](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E7283) | [p3XFLAG-myc-CMV™-26 Expression Vector](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E7283) | Bakterie, savčí buňky | | [E9033](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E9033) | [expresní vektor pFLAG-Myc-CMV™-22](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E9033) | Bakterie, savčí buňky | | [E6908](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E6908) | [pFLAG-CMV™-5.1 Expresní vektor](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E6908) | Bakterie, savčí buňky | | [E9408](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E9408) | [p3xFLAG-Myc-CMV™-25 expresní vektor](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E9408) | Bakterie, savčí buňky | | [FLMAS](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/FLMAS) | [Sestava pro stabilní expresi aminoterminálního FLAG u savců](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/FLMAS) | Bakterie, buňky savců | | [E8158](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E8158) | [pFLAG-ATS™ Expression Vector](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E8158) | Bakterie | | [E8408](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E8408) | [pFLAG-CTC™ Expression Vector](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/E8408) | Bakterie | | [D3404](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/D3404) | [pUC19 plazmidová DNA z *E. coli* RRI](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/D3404) | Bakterie | | [D4154](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/D4154) | [pUC18 plasmidová DNA z *E. coli* RRI](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/D4154) | Bakterie | __Potřebný materiál__ | | | |----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|--------------------------------------------------------------------------------------------| | Reagencie | Vybavení | | T4 DNA ligázový pufr (KEM0049B) | Zkumavky pro PCR reakce | | Plasmidový vektor | Thermocykler (volitelný) | | Vložka (cizí DNA) | Čistící kolona pro PCR ([NA1020](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/NA1020)) | | T4 DNA ligáza ([KEM0020](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/kem0020), [KEM0019](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/kem0019)) | | | Sterilní voda bez nukleázy | | __Následující nastavení reakce pro ligaci__ | | | | |----------------------|------------|---------------------| | Komponent | Objem (µL) | Konečná koncentrace | | T4 DNA ligázový pufr | 2 | 1X | | | | | | Vektor | x | 1-10 ng/µL | | Vložení | 1-10 ng/µL | | | T4 DNA ligáza | 1 | 6U/µl | | Sterilní voda | x | NA | | Celkový objem | 20 | | - Všechny výše uvedené složky přidejte do čisté reakční zkumavky. - Inkubujte 30 minut při 25 °C (lze provést v termocykleru). - Přečistěte DNA pomocí PCR clean-up kolony a eluujte přibližně 50 µl. - Transformujte 0,1-10 ng ligačního produktu do chemických nebo elektrokompetentních buněk kompatibilních s vektorem. ### Transformace Vysoce kvalitní plazmid je pro transformační postup nezbytný. Následující soupravy izolují a purifikují vysoce kvalitní plazmid vhodný pro transformaci. | | | |-------------------------------------------------------------------|----------------------------------------------------------------------------------------------------------------| | Výrobek č. | Název | | [PLN10](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLN10) | [GenElute™ Plasmid Miniprep Kit (10 preps)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLN10) | | [PLN70](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLN70) | [GenElute™ Plasmid Miniprep Kit  (70 preps)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLN70) | | [PLN350](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLN350) | | | [PFM10](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PFM10) | [GenElute™ 5 Minute Plasmid Miniprep Kit (10 preps)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PFM10) | | [PFM50](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PFM50) | [GenElute™ 5 Minute Plasmid Miniprep Kit (50 preps)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PFM50) | | [PFM250](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PFM250) | [GenElute™ 5 Minute Plasmid Miniprep Kit (250 preps)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PFM250) | | [PLX15](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLX15) | [GenElute™ Plasmid Maxiprep Kit (15 preps)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLX15) | | [PLD35](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLD35) | [GenElute™ Plasmid Miniprep Kit (35 preps)](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/PLD35) | Podrobný protokol transformace pomocí chemických nebo elektrokompetentních buněk najdete [](https://www.sigmaaldrich.com)[zde](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and-expression/competent-cells). ### Screening Nabízíme řadu chromogenních substrátů, které pomáhají při screeningu rekombinantních bakterií. Některé produkty lze použít k rozetření na LB agarové plotny (screeningový protokol 1), zatímco jiné se zapracovávají do mikrobiálního média (screeningový protokol 2). Tyto produkty se používají spolu s IPTG, kdekoli je to nutné. Protokoly pro oba postupy jsou uvedeny níže. __Screeningový protokol 1 (platí pro čísla výrobků__ B6650, [16658](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/16658), B2904, B3928, [16669](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sial/16669), [B8931](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/product/sigma/B8931)__)__ - Na LB agarové plotny rozetřete 40 µl nebo odpovídající množství zásobního roztoku chromogenního substrátu a 10 µl roztoku IPTG pomocí sterilního rozmetadla (přidání IPTG při použití výrobku číslo B3928 není nutné, protože již obsahuje IPTG). - Desky by měly obsahovat desky s příslušným antibiotikem a bez antibiotika jako kontroly. - Desky nechte zaschnout v laminární komoře s mírně pootevřenými víčky. - Rozetřete 10-100 µl transformované *E. coli* buněk na LB agarové desky pomocí sterilního rozmetadla. - Inkubujte desky 24-48 hodin při 37 °C. - Na povrchu agaru se objeví modré a bílé kolonie. Vyberte rekombinantní buňky v bílých koloniích ke kultivaci. __Screeningový protokol 2 (platí pro čísla výrobků__ S7313, S9811, C4478__)__ - Připravte LB agar navážením příslušného práškového média, agaru a vody do sterilní baňky. Případně odvažte příslušné množství C4478 a přidejte do vody ve sterilní baňce. - Před autoklávováním přidejte do média 300 mg/l výrobků číslo S7313 a S9811 a 500 mg/l citrátu železito-amonného (číslo výrobku F5879). Tomuto kroku se vyhněte, pokud používáte C4478 - Autoklávujte médium a ochlaďte ho jen natolik, aby bylo možné s baňkou manipulovat. - Přidejte do média vhodnou koncentraci vybraného antibiotika. - Nalijte přibližně 25-30 ml LB agaru do sterilních destiček a nechte je s mírně pootevřenými víčky ztuhnout. - Na destičky LB agaru rozetřete 10-100 µl transformovaných *E. coli* buněk pomocí sterilního rozmetadla. - Inkubujte destičky 24-48 hodin při 37 °C. - Na povrchu agaru se objeví modré a bílé kolonie. Vyberte rekombinantní buňky v bílých koloniích ke kultivaci.  __Obrázek 3.__Výběr modrobílé barvy rekombinantních bakterií pomocí X-gal. ## Omezení modrobílého screeningu - Modrobílá technika je pouze screeningový postup, nejedná se o selekční techniku. - Gen lacZ ve vektoru může být někdy nefunkční a nemusí produkovat β-galaktosidázu. Výsledná kolonie nebude rekombinantní, ale bude se jevit jako bílá. - Je možné, že do MCS bude vložena malá sekvence cizí DNA, která změní čtecí rámec genu lacZ. To má za následek falešně pozitivní bílé kolonie. - Malé inserty uvnitř čtecího rámce genu lacZ mohou vést k nejednoznačným světle modrým koloniím, protože β-galaktosidáza je pouze částečně inaktivována. ### Odkazy 1\. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2\. Padmanabhan S, Banerjee S, Mandi N. [Screening of Bacterial Recombinants: Strategies and Preventing False Positives](http://www.intechopen.com/download/get/type/pdfs/id/21711). [https://doi.org/10.5772/22140](https://doi.org/10.5772/22140) __Související články__ - [Úvod do transfekce buněk](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/transfection-reagents) - [Úvod do transformace kvasinek](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and-expression/introduction-to-yeast-transformation) - [Restrikční endonukleázy - Molekulární nůžky](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and-expression/restriction-endonucleases-the-molecular-scissors) - [Klonování zájmových genů do plazmidového vektoru](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and-expression/restriction-enzyme-cloning-manual-cloning) - [Promotérský systém T7](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and-expression/t7-promoter-system) - [Reverse Transfection of Plasmid DNA](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/xtg-reverse-transfect-pdna) - [3xFLAG® System Expression Vectors for Ultra-Sens](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and-expression/3x-flag) - [Bacterial Transformation Protocols](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and-expression/competent-cells) - [Zobrazit více](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Související kategorie výrobků__ - [Detekční substráty a enzymy](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/protein-biology/proteins-and-enzymes/detection-substrates-and-enzymes) - [Molekulární klonování a exprese proteinů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/molecular-biology-and-functional-genomics/cloning-and-expression/molecular-cloning-and-protein-expression) - [Povrchově aktivní látky – aniontové, kationtové, zwitteriontové, protipěnivé](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/chemistry-and-biochemicals/biochemicals/detergents) - [Sacharidy pro biochemický výzkum](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/chemistry-and-biochemicals/biochemicals/carbohydrates) - [Plazmidová DNA | Soupravy pro purifikaci plazmidů](https://www.sigmaaldrich.com/CZ/cs/products/molecular-biology-and-functional-genomics/nucleic-acid-purification/plasmid-dna-purification) Nejvyšší __Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.__ Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet. Přihlásit__Nemáte účet?__Registrovat Toto je strojově přeložená stránka. An unknown error has occured.