Next Generation Sequencing

NGS-Methoden im Überblick

Da die Methodik und die Reagenzien für NGS ständig weiterentwickelt werden, stehen den Forschern inzwischen zahlreiche NGS-Systeme zur Verfügung. Häufig verwendete Plattformen umfassen mehrere kritische Schritte im NGS-Workflow. Hierzu gehören Proben- oder Bibliotheksvorbereitung, Clustergenerierung, Sequenzierung und Datenanalyse. Die Probenvorbereitung umfasst in der Regel entweder eine DNA-Amplifikation oder die Zugabe von Sequenz-Linkern oder Adaptoren. Die Clusterbildung der einzelnen DNA-Sequenzen erfolgt, wenn die DNA, die den kovalent gebundenen Linker enthält, an eine feste Oberfläche für die Brücken-PCR-Amplifikation hybridisiert, oder durch alternative Methoden wie die Emulsions-PCR. Darüber hinaus gibt es viele DNA-Sequenzierungsmethoden, darunter die Sequenzierung durch Ligation, die Sequenzierung durch Synthese, die Pyrosequenzierung und die Ionen-Halbleiter-Sequenzierung. Jede Sequenzierungsmethode umfasst unterschiedliche Reaktionsschritte und chemische Verfahren, durch die letztlich die Länge der einzelnen Sequenzen (Leseweiten), die Fehlerquote und die Reagenzienkosten bestimmt werden.

Analytische Ansätze für die Analyse von NGS-Daten

Eine letzte Komponente aller NGS-Workflows ist der kritische Schritt der Datenanalyse, der nach der Sequenzierung erfolgt. Während alle NGS-Plattformen und Workflows eine enorme Menge an digitalen Informationen produzieren, die auf Computern erfasst werden, muss der Rohdatensatz von Bioinformatikern analysiert werden, die eine ständig wachsende Anzahl von Analysetools für das Read-Alignment und Mapping einsetzen, wie Bowtie, Galaxy und viele andere. Viele der Entwicklungen auf dem Gebiet der NGS-Technologien sind das Ergebnis des Zusammenschlusses zahlreicher wissenschaftlicher Fachgebiete, um die Analyse und Interpretation derart großer Datensätze zu entwickeln und zu optimieren. Abhängig von den spezifischen Anwendungserfordernissen können Forscher mit diesen leistungsstarken Werkzeugen nun ganze Genome, Exome oder Transkriptome für Grundlagen- und Krankheitsforschungsstudien sequenzieren.