Markierung & Nachweis von Nukleinsäuren

MARKIERUNG VON NUKLEINSÄUREN UND SONDEN

Nukleinsäuren können im gesamten Molekül oder an den 5'- und 3'-Enden markiert werden. Nukleinsäuresonden sind besonders nützlich für Hybridisierungsassays, wie z. B. für den Nachweis von RNA in einem Northern Blot oder von DNA in einem Southern Blot. Es gibt verschiedene Markierungsmethoden, um die Markierung in der gesamten Sonde zu verteilen, darunter PCR mit markierten Desoxynukleotiden (dNTP) oder Nukleotidtriphosphaten (NTP), Zufalls-Priming und Nick-Translation. Die Endmarkierung ist besonders nützlich für Assays zur Untersuchung von Nukleinsäure-Protein-Wechselwirkungen, um sterische Behinderungen zu vermeiden.

Assays für die Markierung und den Nachweis von Nukleinsäuren

Abhängig von der Markierungsmethode wird der kolorimetrische Nachweis oft für enzymmarkierte Sonden eingesetzt, während der autoradiographische Nachweis für radioaktive Sonden geeignet ist. Zu den gebräuchlichen Sonden gehören Digoxigenin(DIG)- und Fluorescein-markierte Sonden, die in Kombination eingesetzt werden können, um den Mehrfarben-Sondennachweis in Verbindung mit kolorimetrischen Reaktionen (z.B. alkalische Phosphatase) zu erleichtern. Ähnlich kann der Einbau von Biotin-16-dUTP mittels PCR ebenfalls bei den meisten DNA-Polymerasen als zusätzliche Markierungs- und Nachweismethode eingesetzt werden. Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung werden fluoreszierende Sonden zum Nachweis von DNA-Sequenzen eingesetzt. Der erfolgreiche Nachweis und die nachfolgende Analyse sind teilweise von der Empfindlichkeit und Auflösung des verfügbaren Fluoreszenzmikroskops abhängig.

Anwendungen mit markierter DNA und RNA

Der Transfer von Makromolekülen auf Festphasenmembranen wird als Blotting bezeichnet. Aufgrund der Spezifität markierter Sonden ermöglicht die Hybridisierung der Nukleinsäure und der Sonde Wissenschaftlern den Nachweis sowohl von DNA- als auch RNA-Sequenzen in komplexen Nukleinsäuregemischen. Diese Methoden ermöglichen je nach Assay auch die Sammlung weiterer wertvoller Informationen wie die Analyse der Genexpression, der mRNA-Größe und der Anzahl an Kopien. Die In-situ-Hybridisierung wird von Wissenschaftlern auch häufig zum Nachweis einer oder mehrerer unterschiedlich markierter Sonden (z.B. DIG- und Fluorescein-markierter Sonden) eingesetzt.