Anwendungen der Polymerasekettenreaktion (PCR)

Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)

Die RT-PCR, oder Reverse-Transkriptase-PCR, ist eine Variation des Standard-PCR-Verfahrens, das die Amplifikation spezifischer mRNA aus sehr kleinen Proben beinhaltet. Sie eliminiert die Notwendigkeit für den mühseligen mRNA-Aufreinigungsprozess, der für konventionelle Klonierungsmethoden erforderlich ist. Bei der RT-PCR werden zusätzlich zu den Standard-PCR-Reagenzien eine reverse Transkriptase und eine RNA-Probe verwendet. Die Reaktionsmischung wird auf 37 ˚C erwärmt, wobei eine komplementäre cDNA-Kopie der RNA-Probe durch reverse Transkriptase hergestellt werden kann. Diese cDNA bindet dann an einen der Primer, wonach die Erststrang-Synthese erfolgt. Ab diesem Schritt wird dann die Standard-PCR durchgeführt, bei der letztendlich die dsDNA erzeugt wird. Die RT-PCR wird häufig mit Echtzeit-PCR (qPCR) kombiniert, die verbreitet zur Quantifizierung der Transkriptmenge in Zellen und Geweben eingesetzt wird.

Heißstart-PCR

Heißstart-PCR ist eine Technologie, die Heißstart-Taq-Polymerase oder den Einbau modifizierter dNTP beim Reaktionsaufbau hemmt, bis eine Hitzeaktivierung stattfindet. Es gibt verschiedene Methoden zur Hemmung der Heißstart-Polymeraseaktivität, wie z.B. chemische Modifikation, antikörpervermittelte und aptamervermittelte Methoden. 

Endpunkt-PCR für lange und präzise Zielamplifikation

Die Endpunkt-PCR wird zum Nachweis des Vorhandenseins von Zielsequenzen und der relativen Abundanz am Ende der Reaktion eingesetzt. Die begrenzte Länge von etwa 5 kb der bei der Standard-PCR hergestellten Sequenzen wird zum Teil durch den Einbau zusätzlicher Faktoren gelöst, die eine „Korrekturleseaktivität“ bereitstellen. Bei der LA- (long and accurate) PCR wird eine zweite thermostabile Polymerase mit 3′→5′ Exonuklease zur Reparatur fehleingebauter terminaler Nukleotide eingesetzt. Dadurch wird eine deutlich höhere Genauigkeit und die Fähigkeit zur Amplifikation von DNA-Zielsequenzen bis zu einer Länge von 40 kb erzielt.