Protokoll Zelldissoziation mit Trypsin
Trypsin in der Zellkultur
Zelldissoziation ist der Prozess während der Zellpassage, in dem die Zellen von der behandelten Oberfläche abgelöst werden, um Suspensionen zu bilden. Diese Suspensionen sind wichtig für die erneute Aussaat in der Subkultur, die Zellzählung für Analysen und die Zellvermehrung. Es gibt verschiedene proteolytische Enzyme, die zur Ablösung von Zellen vom anhaftenden Substrat verwendet werden, darunter Trypsin.
Trypsin ist ein Mitglied der Familie der Serinproteasen, das häufig zur Ablösung von Zellen verwendet wird. Die optimale Aktivität von Trypsin liegt bei 37 °C, daher wird häufig vorgewärmtes Trypsin verwendet, um die Ablösung der Zellen zu beschleunigen. Eine Langzeitinkubation mit hohen Trypsinkonzentrationen kann jedoch die Zellen schädigen, indem Oberflächenproteine abgestreift werden und die Zellen absterben.
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Eigenschaften von Trypsin
Trypsin wird von vielen Zelltypen toleriert. In proteomischen Studien und Experimenten, die serumfreie Kulturen erfordern, wird jedoch häufig auf die Verwendung von Trypsin verzichtet. Abhängig von Anwendung und Zelltyp können verschiedene Inhaltsstoffe und Konzentrationen von Trypsin verwendet werden. Einige dieser Attribute werden nachstehend erläutert.
- EDTA (Dinatrium-Ethylendiamintetraessigsäure): Adhäsionsmoleküle in Gegenwart von Calcium bestimmen die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen. EDTA wird häufig zusammen mit Trypsin integriert, um ein Chelat mit den zweiwertigen Kationen (Ca2+, Mg2+) zu bilden und diese Wechselwirkungen zu schwächen.
- Phenolrot: Trypsin hat seine optimale Aktivität im pH-Bereich von 7 bis 9. In diesem Bereich verleiht das Phenolrot der Lösung eine rosa Farbe. Aufgrund von Umweltbedingungen kann der pH-Wert von Trypsin sauer werden, wodurch es weniger wirksam wird und die Farbe orange annimmt. Durch Einstellen des pH-Werts auf 7,4 - 7,6 mit NaOH konnte die Trypsinaktivität wiederhergestellt werden.
- Verdünnungsmittel: Zur Aufrechterhaltung des pH-Werts und des osmotischen Gleichgewichts kann konzentriertes Trypsin mit einer gepufferten Salzlösung, die kein Ca2+ oder Mg2+ enthält, wie z. B. Hank's Balanced Salt Solution, verdünnt oder solubilisiert werden. Einige Trypsinprodukte können auch in 0,9 % NaCl verdünnt werden.
- Quelle und Form: Die Hauptquelle für Trypsin ist porzin, entweder als lyophilisiertes Pulver oder als Lösung. Um tierische oder mikrobielle Produkte zu vermeiden, wird rekombinantes Rindertrypsin, TrypZean-Lösung, in Mais exprimiert.
- Konzentration: Je nach Zelltyp und Anwendung wird Trypsin in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt. Bei stark adhärenten Zelllinien wird Trypsin in einer Konzentration von 2,5 % bis 0,25 % (10X bis 1X) verwendet. Niedrigere Konzentrationen von Trypsin, wie z. B. 0.05 %, können für Studien verwendet werden, bei denen die Integrität der Zelloberflächenproteine erhalten bleiben muss.
Protokoll Trypsinierung
Dieses Protokoll wird in einer aseptischen Umgebung durchgeführt, wie z. B. in einer bioüberwachten Laminar-Flow-Haube.
- Die Trypsinlösung, die ausgeglichene Salzlösung (Ca+2- und Mg+2-freie Lösung) und das Wachstumsmedium auf 37 °C vorwärmen.
- Die Zellen untersuchen, um sicherzustellen, dass die Zellen gesund und frei von Verunreinigungen sind.
- Das Nährmedium aus dem Kolben entnehmen und verwerfen.
- Die Zellen vorsichtig mit ausgeglichener Salzlösung ohne Ca+2- und Mg+2-Ionen spülen und die Lösung entnehmen. Fest haftende Zellen können auch mit Trypsinlösung gewaschen werden. Für empfindliche Zellen wird jedoch eine ausgeglichene Salzlösung bevorzugt.
- Eine angemessene Menge (0,5 ml/10 cm2) vorgewärmter Trypsinlösung an die Seitenwand des Kolbens geben. Den Inhalt vorsichtig schwenken, um die Zellschicht zu bedecken.
- Das Gefäß bei Raumtemperatur 2–3 Minuten inkubieren (die Inkubationszeit hängt von der verwendeten Zelllinie ab). Fest haftende Zellen können schnell bei 37 °C abgelöst werden. Die Zellen unter dem Mikroskop beobachten. Die abgelösten Zellen erscheinen unter dem Mikroskop rund und lichtbrechend. Wenn sich weniger als 90 % der Zellen abgelöst haben, den Kolben weitere 2 Minuten inkubieren und die Zellen im Abstand von 30 Sekunden unter dem Mikroskop beobachten.
Hinweis: Vermeiden Sie, dass die Zellen über einen längeren Zeitraum (>=10 min) einer Trypsinlösung ausgesetzt werden. - Sobald sich die Zellen abzulösen scheinen, zwei Volumina vorgewärmtes vollständiges Wachstumsmedium hinzufügen, um Trypsin zu inaktivieren. Das Medium vorsichtig durch mehrmaliges Pipettieren über die Oberfläche der Zellschicht dispergieren, um sicherzustellen, dass mehr als 95 % der Zellen wiedergefunden werden. Bei serumfreien Kulturen wird Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in äquimolarer Konzentration zugesetzt, um das Trypsin zu hemmen.
Hinweis: Kräftiges Pipettieren kann zu Zellschäden führen. - Die Zellsuspension in das Röhrchen geben und 5-10 min bei 100–300 g vorsichtig zentrifugieren. Nach Entfernen des Überstands das Zellpellet vorsichtig in vorgewärmtem vollständigem Wachstumsmedium resuspendieren. Die erforderliche Probe entnehmen, um die Zelldichte der viablen Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Ausschluss oder einem automatischen Zellzähler zu bestimmen.
- Die verbleibende Lösung auf die Aussaatdichte verdünnen, das entsprechende Volumen in die Kulturflasche pipettieren und in den Inkubator stellen.
| Kolbenbereich | Medienvolumen |
|---|---|
| 25 cm2 | 5 – 10 ml |
| 75 cm2 | 10 – 30 ml |
| 175 cm2 | 40 – 150 ml |
Zugehörige Materialien
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Literatur
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