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Anzeichen für eine schlechte Optimierung sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten sowie ineffiziente und unempfindliche Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen.  Ein Ansatz zur Assay-Optimierung besteht darin, die optimale Hybridisierungstemperatur (Ta) der Primer zu bestimmen, indem identische Reaktionen mit einer feststehenden Primer-Konzentration über einen ganzen Bereich von Hybridisierungstemperaturen getestet werden. Dies kann erreicht werden, wenn ein qPCR-Gerät mit einem Temperaturgradientenblock zur Verfügung steht. In dem in diesem Protokoll vorgestellten Format sind die Primer in einer Endkonzentration von 450 nM enthalten und der Gradient ist quer zur X-Achse des Blocks so ausgerichtet, dass alle Spalten der gleichen Ta ausgesetzt sind (d. h. 12 verschiedenen Temperaturen). Bei anderen Geräten verläuft der Gradient entlang der Spalte, sodass alle Zeilen den gleichen Ta-Wert aufweisen (d. h. 8 unterschiedliche Temperaturen). Das folgende Protokoll kann, wenn auch mit geringfügigen Änderungen, auf beide angewandt werden. ## Ausrüstung - Gerät für die quantitative PCR mit integrierter Gradientenblock-Kontrollfunktion - Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional) ## Reagenzien - cDNA 1:5-1:10 verdünnt, gDNA 10 ng, synthetisches Oligo (10.000 Kopien) oder anderes geeignetes Template zur Optimierung. - KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ ([KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/KCQS00); gerätespezifisch, siehe Tabelle P17-42). - Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität ([W1754](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/W1754) oder [W4502](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/W4502)) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden. - Konzentrierte Stammlösung für Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM Arbeitslösung: GOI). \- Kundenspezifische Oligos können unter sigmaaldrich.com/oligos bestellt werden. Hot Start ReadyMixes (Taq, Puffer, dNTP, Referenzfarbstoff, MgCl2) KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, [Art.-Nr. KCQS00](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/KCQS00)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox , [Art.-Nr. KCQS01](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/KCQS01)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ mit ROX, [Art.-Nr. KCQS02](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/KCQS02)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ für iQ, [Art.-Nr. KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/KCQS03) __Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:__ Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700  Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900  Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast  Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT  Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s    Illumina Eco qPCR    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q    Roche LightCycler® 480    Tabelle P17-42. SYBR Green PCR-Mix Auswahl-Leitfaden ## Materialien - Sterile Filter-[Pipettenspitzen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/CLS430909) - PCR-Röhrchen und -Platten. Treffen Sie ihre Auswahl, um das gewünschte Format zu erhalten: •    Einzelne dünnwandige 200 μl-PCR-Röhrchen ([Z374873](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/Z374873) oder [P3114](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/P3114)) •    Platten \- [96-Well-Platten (Z374903)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/Z374903)       - [384-Well-Platten (Z374911)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/Z374911) •    Plattendichtungen \- [ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/Z734438)       - [ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/product/sigma/Z722553) ### Anmerkungen zu diesem Protokoll - Die cDNA wird mit Hilfe eines Zufallsprimers oder einer Oligo-dT-Priming-Methode erzeugt und für die Verwendung 1:10 verdünnt. Es kann alternativ jedes geeignete Template eingesetzt werden. - Alle Reaktionen werden in doppelter Ausführung als technische Replikate durchgeführt. - Wenn Sie eine PCR-Platte verwenden, folgen Sie einem Plattenschema (z. B. in __Abbildung P14-19__), um sicherzustellen, dass die Reaktionsmischung, die Proben und die Kontrollen in die richtigen Wells gegeben werden.   ## Methode 1.    Vorbereitung eines Mastermix für 56 Reaktionen gemäß __Tabelle P14-35__. Gut mischen, damit keine Blasen entstehen. ReagenzienVolumen (μl) pro 20 μl-EinzelreaktionVolumen (μl) für 56 Reaktionen KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 2x10560 Vorwärtsprimer (10 μM)0,950,4 Rückwärtsprimer (10 μM)0,950,4 Wasser in PCR-Qualität4,2235,2 Tabelle P14-35. Reaktions-Mastermix zur Ta-Optimierung 2.    Entnehmen Sie 448 μl des Mastermix aus Schritt 1 (d. h. die Hälfte) in ein separates Röhrchen für den Aufbau der NTC-Reaktionen (Negativkontrolle). 3.    Fügen Sie 112 μl des Templates zum restlichen Mastermix aus Schritt 2 hinzu. Legen Sie das Mastermix des Templates auf Eis. 4.    Fügen Sie der anderen Hälfte des Mastermix aus Schritt 2 112 μl Wasser hinzu. NTC-Mastermix auf Eis legen. 5.    Aliquotieren Sie 20 μl-Mastermix des Templates aus Schritt 3 in zwei Reihen der PCR-Platte mit der Bezeichnung GOI. 6.    Aliquotieren Sie 20 μl NTC-Mastermix aus Schritt 4 in zwei Reihen der PCR-Platte mit der Bezeichnung NTC. 7.    Platten abdecken und beschriften. (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt) 8.    Lassen Sie die Proben gemäß dem nachstehenden dreistufigen Protokoll durchlaufen (*__Hinweis:__* Diese Bedingungen sind spezifisch für FAST-Zyklusprotokolle). Durch sie wird sichergestellt, dass die Hybridisierungstemperatur auf einem Gradienten zwischen der niedrigsten und der höchsten Temperatur, welche für die Primer geeignet ist, definiert wurde (Beispiel: 54-70 °C). Die Schritte 1-3 werden in 40 Zyklen wiederholt. Nach der Amplifikation wird eine Standard-Dissoziationskurve erstellt. | | | | |------------------------------------------------------|------------------|----------| | FAST-Zyklusbedingungen | Temp. (ºC) | Zeit (s) | | Anfängliche Denaturierung/Hot Start | 95 | 30 | | __Die Schritte 1-3 werden in 40 Zyklen wiederholt.__ | | | | Schritt 1 | 95 | 5 | | Schritt 2 | 54-70 (Gradient) | 15 | | Schritt 3 | 72 | 10 | Tabelle P14-36. FAST-qPCR-Zyklusbedingungen für Ta-Optimierung *__Hinweis:__* Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung).  __Abbildung P14-19.__Plattenlayout für Ta-Optimierung mit identischem Ta für jede Spalte. *__Hinweis:__* Die Verteilung der Proben und Kontrollen über den Temperaturgradienten. Wenn das Gerät über einen Temperaturgradienten verfügt, der vertikal über den Plattenverlauf variiert, müssen die Proben und Kontrollen entsprechend neu angeordnet werden. ## Materialien Bitte entschuldigen Sie, es ist ein unerwarteter Fehler aufgetreten Response not successful: Received status code 500 __Zugehörige Artikel__ - [Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) - [PCR-Assay-Optimierung und Validierung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) - [DNA-Oligonukleotid-Synthese](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/dna-oligonucleotide-synthesis) - [Verbrückte Nukleinsäure](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/locked-nucleic-acids-faq) - [Quantifizierung von Oligonukleotiden](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/quantitation-of-oligos) - [Fehlerbehebung in der RT-PCR/ RT-qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting) - [PCR/qPCR-Datenanalyse](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/data-analysis) - [Doppelt markierte Sonden](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/dual-labeled-probes) - [Mehr anzeigen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Zugehörige Produktkategorien__ - [Siegelfilme, Folien & Klebebänder](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Pipettenspitzen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) Oben __Melden Sie sich an, um fortzufahren.__ Um weiterzulesen, melden Sie sich bitte an oder erstellen ein Konto. 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Entwicklung. Produktion.__ Wir sind ein führender Anbieter für die globale Life Science Industrie mit Lösungen und Dienstleistungen für die Forschung, die biotechnologische Entwicklung und Produktion sowie die pharmazeutische Entwicklung und Produktion von Medikamenten. [](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de) [Sigma-Aldrich® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/life-science/sigma-aldrich)[BioReliance® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/life-science/bioreliance)[Millipore® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/life-science/millipore)[SAFC® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/life-science/safc)[Milli-Q® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/life-science/milliq)[Supelco® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/life-science/supelco) © 2026 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland und/oder ihre Tochtergesellschaften. Alle Rechte vorbehalten, einschließlich Text und Data Mining für KI-Training und ähnliche Technologien. 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[mRNA-Entwicklung und -Herstellung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/mrna-development-manufacturing) - [mRNA-Analytik und Qualitätskontrolle](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/mrna-development-manufacturing/mrna-analytical-quality-control) - [mRNA-Entwicklung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/mrna-development-manufacturing/mrna-development) - [mRNA-Herstellung und -Formulierung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/mrna-development-manufacturing/mrna-manufacturing-formulation) - [mRNA-Forschung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/mrna-development-manufacturing/mrna-research) - [Pharma- und Biopharma-Herstellung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing) - [Pharmazeutische Wirkstoffe](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/active-pharmaceutical-ingredients) - [API-Verarbeitungschemikalien](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/active-pharmaceutical-ingredients/api-processing-chemicals) - [Folate](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/active-pharmaceutical-ingredients/folates) - [Portfolio-APIs](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/active-pharmaceutical-ingredients/portfolio-apis) - [Bioprozessierung & Formulierung Rohstoffe](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-formulation-raw-materials) - [Flüssige Zellkulturmedien und Puffer für die Bioprozessierung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-formulation-raw-materials/liquid-cell-culture-media-buffers) - [Puffer & pH-Einsteller](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/buffer-media-prep/buffers-and-ph-adjusters) - [Reinigung an Ort und Stelle](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-formulation-raw-materials/cleaning-in-place) - [Detergenzien für biopharmazeutische Anwendungen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-formulation-raw-materials/detergents) - 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[Formulierung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation) - [Aktivierte und funktionalisierte PEGs](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/activated-functionalized-pegs) - [Formulierung von Biomolekülen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/biomolecule-formulation) - [Granulierte Materialien](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/granulated-materials) - [Injektionsmittel und parenterale Formulierungen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/injectables-parenteral-formulations) - [Flüssige Formulierung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/liquid-formulation) - [Protein-Stabilisatoren](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/protein-stabilizers) - 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[Dünnschichtchromatographie (TLC)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/analytical-chemistry/thin-layer-chromatography) - [Titration und Karl Fischer](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/analytical-chemistry/titration-and-karl-fischer) - [Wasser für die analytische Chemie](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/water-purification/water-analytical-chemistry) - [Nasschemische Analyse](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/analytical-chemistry/wet-chemical-analysis) - [Zellkultur & Analyse](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis) - [Zellanalyse](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-analysis) - [Zellbasierte Assays](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-analysis/cell-based-assays) - [Zellzählung und Gesundheitsanalyse](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-analysis/cell-counting-and-health-analysis) - [Bildgebende Analyse und Live-Zell-Bildgebung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-analysis/imaging-analysis-and-live-cell-imaging) - [Zellkultur nach Zelltyp](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-culture-by-cell-type) - [Säugetierzellkultur](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-culture-by-cell-type/mammalian-cell-culture) - [Mikrobielle Zellkultur](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-culture-by-cell-type/microbial-cell-culture) - [Pflanzen-Gewebekultur](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-culture-by-cell-type/plant-tissue-culture) - [Primäre Zellkultur](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-culture-by-cell-type/primary-cell-culture) - [Stammzellkultur](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-culture-by-cell-type/stem-cell-culture) - 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[Präklinische Entwicklung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/monoclonal-antibodies/antibody-drug-discovery/preclinical-development) - [Ziel Entdeckung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/monoclonal-antibodies/antibody-drug-discovery/target-discovery) - [Charakterisierung und Qualitätskontrolle](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/monoclonal-antibodies/characterization-and-quality-control) - [Aggregierte Analyse](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/monoclonal-antibodies/characterization-and-quality-control/aggregate-analysis) - [Analyse der intakten Masse](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/monoclonal-antibodies/characterization-and-quality-control/intact-mass-analysis) - [Peptid-Mapping](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/monoclonal-antibodies/characterization-and-quality-control/peptide-mapping) - [Posttranslationale Modifikation](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/monoclonal-antibodies/characterization-and-quality-control/post-translational-modification-analysis) - 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[mRNA-Entwicklung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/mrna-development-manufacturing/mrna-development) - [mRNA-Herstellung und -Formulierung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/mrna-development-manufacturing/mrna-manufacturing-formulation) - [mRNA-Forschung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/mrna-development-manufacturing/mrna-research) - [Pharma- und Biopharma-Herstellung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing) - [Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/adc-manufacturing) - [Konjugation](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/adc-manufacturing/conjugation) - [Klärung](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/applications/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/adc-manufacturing/antibody-drug-conjugate-manufacturing-purification) - [Biopharma 4.0](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/biopharma-4-0) - [Software zur Automatisierung und Steuerung von Bioprozessen](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/biopharma-4-0/bioprocessing-automation-control-software) - [Software für die Datenanalyse in der Bioprozesstechnik](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/biopharma-4-0/bioprocessing-data-analytics-software) - [Geschlossene Verarbeitung für die Bioproduktion](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/biopharma-4-0/closed-processing-for-biomanufacturing) - [Intensivierte & kontinuierliche Upstream-Verarbeitung (USP)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/biopharma-4-0/intensified-upstream-processing) - [Verstärkte und kontinuierliche nachgelagerte Verarbeitung (DSP)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/biopharma-4-0/intensified-continuous-downstream-processing) - [Prozessanalytische Technologie (PAT)](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/integrated-offerings/biopharma-4-0/process-analytical-technology) - 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