Herstellungsstrategien für mRNA-Impfstoffe und -Therapeutika

Mit einem komprimierten Zeitrahmen von der Entwicklung bis zur Klinik bietet die mRNA-Technologie bietet vielversprechende Möglichkeiten, nicht nur als schnelles und wirksames Mittel zur Reaktion auf den Ausbruch von Infektionskrankheiten, sondern auch für die Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten mit ungedecktem Bedarf. Die mRNA-Technologien bieten mehrere Vorteile: ein ausgezeichnetes Sicherheitsprofil, ein hohes Maß an Vielseitigkeit und einen einfachen Herstellungsprozess.

Aufgrund des frühen Erfolgs von mRNA-Impfstoffen sind die heutigen mRNA-Hersteller bestrebt, die Effizienz und Produktivität ihrer Produktionsprozesse zu erhöhen, indem sie die mRNA-Stabilität verbessern und Strategien zur Verbesserung der pDNA- und mRNA-Reinigung und zur Erweiterung der GMP-Produktion umsetzen.

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Kapitelübersicht

• Berücksichtigungen für die mRNA-Herstellung
• Herstellung von mRNA
• Reinigung von mRNA
• Erwägungen zur Skalierung

Erwägungen zur mRNA-Herstellung

Die Herstellung von mRNA-Impfstoffe und -Therapeutika von mRNA-Impfstoffen und -Therapeutika folgt in der Regel einem Schablonenprozess (Abbildung 1). Diese vereinfachte Herstellungsvorlage verwendet dieselben Reaktionsmaterialien für jedes Zielmolekül und ermöglicht es mRNA-Herstellern, neue Zielmoleküle mit minimalen Prozessanpassungen herzustellen.

Abbildung 1. Allgemeine Prozessübersicht für die mRNA-Herstellung.

Einige Schlüsselentscheidungen haben einen großen Einfluss auf den Prozess, die Ausbeute und die Qualität des mRNA-Endprodukts, und eine davon ist die Qualität der Prozesschemikalien und Rohstoffe. Besonders während der in-vitro Transkription und der anschließenden Aufreinigung ist die mRNA ungeschützt und einem hohen Risiko des enzymatischen Abbaus ausgesetzt. Die Verwendung hochwertiger Chemikalien, die auf Abwesenheit von Endonuklease-Aktivität getestet sind, minimiert das Risiko eines RNase-induzierten Abbaus und verbessert die mRNA-Stabilität während der gesamten Aufreinigung und Formulierung des mRNA-Arzneimittelprodukts.

Diese Webseite hilft Ihnen bei der Bewältigung dieser und anderer Herausforderungen, indem sie Informationen über unsere umfassenden, integrierten Lösungen zur Rationalisierung Ihrer mRNA-Herstellung bietet. Unsere Broschüre "Prozesschemikalien für die Herstellung von mRNA-Medikamenten" enthält die Details, die Sie benötigen, um eine fundierte Entscheidung zu treffen.

mRNA: Strukturelemente und ihre Funktionen

Das mRNA-Konstrukt ist so konzipiert, dass eine effiziente Expression des betreffenden Gens gewährleistet ist. Stabilität, Genexpression und effiziente Proteintranslation hängen von mehreren Strukturelementen ab (Abbildung 2):

Abbildung 2. mRNA-Struktur.

• Cap-Region am 5'-Ende der Sequenz: Wesentlich für die mRNA-Reifung, die Erkennung durch das Ribosom für eine effiziente Proteinübersetzung und den Schutz vor Nuklease-Verdauung für eine verbesserte Stabilität.
• Untranslatierte Regionen (UTRs) an den stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Bereichen der mRNA-Kodierungsregion: Regulierung der mRNA-Translation, -Lokalisierung und -Stabilität; kann zur Verbesserung der Proteinexpressionseffizienz genutzt werden.
• Offener Leserahmen oder kodierender Sequenzbereich: Enthält das Gen von Interesse (GOI).
• Poly(A)-Schwanz: Entscheidend für die Proteintranslation und die mRNA-Stabilität, da er den Verdau durch 3'-Exonuklease verhindert.

Making mRNA

Produktion von mRNA-basierten Therapeutika und Impfstoffen beginnt mit einer Plasmid-DNA (pDNA)-Vorlage, die dann linearisiert und in mRNA umgeschrieben wird.

• pDNA-Produktion: Die pDNA-Vorlage enthält einen DNA-abhängigen RNA-Polymerase-Promotor und die Sequenz für das mRNA-Konstrukt. Die pDNA wird in Bakterienzellen amplifiziert, die dann geerntet und lysiert werden, um die zirkuläre pDNA freizusetzen. Dieses Lysat ist extrem zähflüssig, da es die pDNA und andere große, negativ geladene Verunreinigungen wie RNA, genomische DNA und Endotoxine aus den Bakterienzellen enthält, was die Reinigung erschwert.
• pDNA-Reinigung: Die Reinigung der pDNA-Vorlage von Verunreinigungen sollte die Trennung maximieren und gleichzeitig das Potenzial einer mechanischen Beschädigung der Plasmidvorlage minimieren. Gereinigte, zirkuläre pDNA wird dann linearisiert, um Transkriptionsereignisse zu vermeiden, die unerwünschte mRNA-Sequenzvarianten erzeugen können, die entfernt werden müssen.¹ Diese linearisierte pDNA-Vorlage wird weiter gereinigt, um Verunreinigungen wie das für die Linearisierung verwendete Restriktionsenzym, Rinderserumalbumin (BSA), DNA-Fragmente und Endotoxine zu entfernen. Da die pDNA-Vorlage in der Regel in Bakterienzellen hergestellt wird, sind Endotoxin-Verunreinigungen eine kritische Verunreinigung, die sich auf die nachfolgenden Reinigungsschritte auswirkt. Detergenzien wie Deviron^® C16 Detergenz können zur wirksamen Entfernung von Endotoxinen verwendet werden und sind eine nachhaltige, biologisch abbaubare und REACH-konforme Alternative zu herkömmlichen Detergenzien.²

Es gibt deutliche Unterschiede in der Vorgehensweise bei der pDNA-Reinigung im Labor- und GMP-Produktionsmaßstab. Bei Prozessen im Labormaßstab werden häufig Lösungsmittelextraktionsverfahren verwendet, um pDNA von anderen Komponenten zu trennen, aber die Handhabung und Entsorgung dieser Chemikalien im großen Maßstab kann eine Herausforderung darstellen. Im Gegensatz dazu werden in GMP-Produktionsumgebungen in der Regel Tangentialflussfiltration (TFF) und Chromatographie zur effizienten Entfernung von Verunreinigungen eingesetzt.

In-vitro Transkription (IVT): Die linearisierte und gereinigte pDNA wird dann in einer enzymatischen Reaktion in mRNA umgeschrieben.

• Kritische Komponenten für die in-vitro Transkription sind u.a. die RNA-Polymerase, die die Transkription der DNA in mRNA katalysiert; Ribonukleosidtriphosphate (rNTPs), die als Bausteine der mRNA dienen; anorganische Pyrophosphatase (IPP), die die mRNA-Ausbeute erhöht; und RNase-Inhibitoren, die den RNA-Abbau verhindern. Der Transkriptionspuffer enthält in der Regel Dithiothreitol (DTT), um Disulfidbindungen zu reduzieren und RNase-Aktivität zu hemmen, während Spermidin enthalten ist, um die Transkriptionseffizienz zu verbessern und die Nukleinsäuren zu stabilisieren. Um das Risiko eines enzymatischen Abbaus in diesem kritischen Prozessschritt zu minimieren, ist es wichtig, Chemikalien auszuwählen, die auf das Fehlen von Endonuklease-Aktivität getestet wurden. Einen umfassenden Überblick über unsere hochwertigen Chemikalien und Hilfsstoffe, einschließlich eines breiten Portfolios endonukleasefreier Produkte, finden Sie in unserer Broschüre "Prozesschemikalien für die mRNA-Medikamentenherstellung".
• Überwachung der Transkription: Kritische Prozessparameter (CPPs) sollten während der IVT-Reaktion überwacht werden, um kritische Qualitätsmerkmale (CQAs) zu kontrollieren und eine optimale Verarbeitung zu gewährleisten. Eine wirksame Überwachung ermöglicht eine kontrolliertere Herstellung und schnellere Reaktionen auf Prozessschwankungen.

Capping: Nach der Transkription wird eine 5'-Cap-Struktur an das mRNA-Transkript angefügt, um die Stabilität und die Transduktion in der Wirtszelle zu verbessern. Das Cap kann auf zwei Arten hinzugefügt werden:

• Co-transkriptionelles Capping: wird während des IVT-Schritts durchgeführt. Effizienz und Ausbeute sind jedoch gering, und bei diesem Ansatz können aufgrund einer falschen Bindung oder eines umgekehrten Einbaus nicht verkappte Verunreinigungen entstehen.
• Enzymatische Verkappung (oder posttranslationale Verkappung) wird nach der mRNA-Aufreinigung durchgeführt. Bei diesem Ansatz wird in der Regel ein Kappungsenzym verwendet, um die Kappe an die gereinigte mRNA anzufügen. Diese Methode ist zwar effizienter, aber auch teurer und stellt einen zusätzlichen Verarbeitungsschritt nach der Reinigung dar.

Reinigung von mRNA

Nach der in-vitro Transkription wird die mRNA von den in den vorherigen Schritten verwendeten Verunreinigungen und Materialien wie Endotoxinen, immunogener doppelsträngiger RNA (dsRNA), Rest-DNA-Template, RNA-Polymerase und elementaren Verunreinigungen gereinigt. Es stehen mehrere Optionen für mRNA-Reinigung und Entfernung von DNA-Resten.

Chromatographische Trennung wie Umkehrphasen-Ionenpaar (IPRP), Anionenaustausch (AEX) und Affinitätschromatographie (AC) mit Poly(dT)-Capture (Abbildung 3) reinigt das mRNA-Target effizient und entfernt die DNA-Matrize, so dass kein DNA-Verdau mehr erforderlich ist^{1, 3}. Die Chromatographie wird auch nach dem enzymatischen Capping eingesetzt, um unerwünschte mRNA-Transkripte und Oligonukleotid-Verunreinigungen zu entfernen.

Abbildung 3: Vergleich von Umkehrphasen-Ionenpaar-, Anionenaustausch- und Affinitätschromatographie für die mRNA-Aufreinigung (DBC: dynamische Bindungskapazität).^4,5

• Umkehrphasen-Ionenpaarung (IPRP)kann in kleinem Maßstab verwendet werden, um die einzelsträngige Ziel-RNA (ssRNA) effizient einzufangen und von Verunreinigungen zu trennen. Da diese Methode jedoch Lösungsmittel erfordert, ist sie für die GMP-Herstellung weniger geeignet und eignet sich besser zum Polieren als zum Abfangen.
• Anionenaustausch-Chromatographie (AEX) hat eine hohe dynamische Bindungskapazität und entfernt effizient Verunreinigungen wie dsRNA, nicht verkappte RNA, RNA-DNA-Hybride und andere RNA-Strukturen wie Hairpin-mRNA. AEX verwendet zwar wässrige Lösungen, erfordert aber potenziell toxische chaotrope Mittel und Betriebstemperaturen von bis zu 85 °C, um große, an das Harz gebundene mRNA-Moleküle zu desorbieren.
• Affinitätschromatographie (AC) Poly(dT)-Capture verwendet ein Harz, um spezifisch den Poly(A)-Schwanz von mRNA-Transkripten in voller Länge zu erfassen. Mit dieser Methode werden DNA, Nukleotide, Enzyme, Pufferbestandteile und alle anderen Verunreinigungen, die keinen Poly(A)-Schwanz haben, effizient entfernt. Aus diesem Grund wird AC üblicherweise für den anfänglichen mRNA-Einfang verwendet, gefolgt von AEX zum Polieren.
• Die endgültige Konzentration und Diafiltration wird im Anschluss an den/die Chromatographieschritt(e) durchgeführt, um die Produktreinheit zu maximieren und die mRNA in den entsprechenden Puffer für die Formulierung oder Lagerung zu überführen.

Scale-up-Erwägungen

Single-use-Technologien bieten Skalierbarkeit, Anpassungsfähigkeit und Qualität für Hersteller mit einer großen Pipeline an Zielmolekülen und sind eine wichtige Voraussetzung für viele mRNA-GMP-Herstellungsverfahren. Die GMP-Herstellung nutzt die Vorteile von TFF- oder Chromatographieschritten für eine effiziente Trennung im großen Maßstab und ersetzt alternative Reinigungsmethoden, die für die Prozessentwicklung im kleinen Maßstab typisch sind. Folgende Überlegungen sind zu berücksichtigen:

• TFF- oder Chromatographieschritte ersetzen Lösungsmittelextraktions- und Fällungsschritte, die häufig in der mRNA-Prozessentwicklung verwendet werden.
• Wo immer möglich, müssen hochwertige Chemikalien und endonukleasefreie Reagenzien verwendet werden, um die mRNA-Stabilität zu verbessern und die Möglichkeit des mRNA-Abbaus zu minimieren.

In den letzten Jahren wurden große Erfolge bei der Einführung von mRNA-Impfstoffen bei großen Patientengruppen erzielt. Auch wenn es nach wie vor Herausforderungen gibt, hat die Konzentration auf die Maximierung der mRNA-Stabilität durch die Verwendung hochwertiger Chemikalien und endonukleasefreier Reagenzien sowie die Optimierung und Anpassung chromatographischer Reinigungstechnologien zur Maximierung der Abtrennung und Rationalisierung des Scale-up zu großen Fortschritten bei den GMP-Herstellungsvorlagen geführt.

Um sicherzustellen, dass die mRNA-Technologie ihr volles Potenzial ausschöpft, sind innovative Lösungen, Fachwissen und Einfallsreichtum erforderlich, damit sich robuste Plattformen im Produktionsmaßstab entwickeln können. Mit unseren Produkten, Dienstleistungen und technischem Know-how engagieren wir uns für die Entwicklung integrierter Lösungen zur Rationalisierung Ihrer mRNA-Herstellung.

Referenzen

1. Bancel S, Issa J, Aunins J. Ribonucleic acid purification (Patent No. WO2014152031A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152031A1/en

2. Kiesewetter A, Gupta A, Heinen‐Kreuzig A, Greenhalgh T, Stein A. 2023. Improved endotoxin removal using ecofriendly detergents for intensified plasmid capture. Biotechnology Progress. 39(6): https://doi.org/10.1002/btpr.3375

3. Bancel S, Issa J, Aunins J, Chakraborty T. 2014. Manufacturing methods for production of rna transcripts (Patent No. WO2014152027A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152027A1/en

4. Issa J, Barberio J, Aunins J, Aefyan N. Ion exchange purification of mRNA (Patent No. WO2014144767A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014144767A1/en

5. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, Shi Y, Sadtler K, Gao W, Lin J, et al. 2019. Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nat Biotechnol. 37(10):1174-1185. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3