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Purificación de muestras

Gráfico que ilustra las fases fundamentales de la separación por cromatografía de afinidad: unión, lavado y elución.

Pueden aplicarse varios métodos de purificación química y física para separar o concentrar un analito específico antes del análisis. Entre ellos se cuentan la absorción, la adsorción, la cromatografía, la destilación, la extracción, el intercambio iónico, la filtración, la formación de complejos, la cristalización, el secado y muchos otros. La preparación de la muestra antes del análisis ayuda a llevar la muestra a un formato compatible con la técnica analítica, reduce la complejidad de la muestra, elimina las impurezas que puedan interferir y concentra el analito antes del análisis. Una preparación adecuada de la muestra evitará la obstrucción, puede reducir la necesidad de procedimientos de lavado rigurosos y puede prolongar la vida útil del medio cromatográfico.


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Algunas de las siguientes técnicas de purificación más comunes se utilizan en el laboratorio para preparar muestras para los análisis consecutivos.

Diálisis

La diálisis es una técnica de purificación que se utiliza para eliminar la sal u otras moléculas de bajo peso molecular de una muestra. También se utiliza para cambiar la composición amortiguadora de una muestra. La diálisis es una técnica pasiva que requiere grandes volúmenes de disolución tampón.

Cambio de amortiguador y desalación

La desalación es un método sencillo para eliminar sales u otros contaminantes de bajo peso molecular de una muestra. También se utiliza para el cambio de tampón antes o después de diferentes etapas cromatográficas y para la rápida eliminación de reactivos para terminar una reacción.

Precipitación fraccional

La precipitación fraccional se utiliza para quitar impurezas macroscópicas de pequeños volúmenes de muestra. Las técnicas de precipitación separan las fracciones mediante el principio de solubilidad diferencial. Dado que las especies proteicas difieren en su grado de hidrofobicidad, el aumento de las concentraciones salinas puede intensificar las interacciones hidrófobas entre las proteínas y causar precipitación.

Extracción

La preparación de la muestra por extracción consiste en el aislamiento de analitos específicos de una muestra compleja o de un volumen de muestra mucho más grande. Durante el proceso se retiran componentes de la muestra que puedan causar interferencias y bloquear las columnas de HPLC y CG. También se aumenta la concentración de analitos en un factor de 100 a 5 000, mejorando así de forma significativa la sensibilidad de la detección. Como parte de la preparación selectiva y específica de la muestra, la extracción contribuye a asegurar un análisis cromatográfico más fiable. Los tipos de extracción son la extracción líquido-líquido, la extracción en fase sólida (SPE) y la microextracción en fase sólida (SPME).

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad separa las proteínas en función de interacciones reversibles entre una proteína y un ligando específico que ha sido acoplado a una matriz cromatográfica. La técnica es muy selectiva y permite una gran capacidad de purificación de proteínas. La cromatografía de afinidad puede utilizarse siempre que se disponga de un ligando adecuado para la proteína de interés.

La purificación mediante cromatografía de afinidad implica etapas de captura y elución. En la fase de captura, la proteína deseada se une de forma específica y reversible a un ligando complementario que ha sido inmovilizado en una matriz cromatográfica. El objetivo es aislar, concentrar y estabilizar el producto deseado, conservando su potencia y actividad. Después de lavar la matriz para quitar el material no unido, la proteína específica unida se recupera cambiando las condiciones a otras que favorezcan la elución. La elución se realiza de manera específica, utilizando un ligando competitivo, o no específica, cambiando el pH, la fuerza iónica o la polaridad. La elución permite recoger la proteína deseada en forma purificada y concentrada.