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Marcaje y detección de los ácidos nucleicos

Métodos y protocolos de marcaje y detección del ADN y el ARN

La gama de métodos de marcaje y detección de ácidos nucleicos, productos de la PCR y oligonucleótidos es muy variable. Los reactivos y métodos que suelen utilizarse para marcar y detectar los ácidos nucleicos vienen determinados por varios factores, como el tipo de molécula que será marcada y la aplicación en la que se utilizará a continuación. Después, se utilizan métodos enzimáticos y químicos para marcar los ácidos nucleicos e incorporar diversas moléculas, como fluoróforos, enzimas y elementos radiactivos.

MARCAJE DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Y SONDAS

Los ácidos nucleicos pueden marcarse en el interior de la molécula o en los extremos de 5’ y 3’. Las sondas de ácidos nucleicos son particularmente útiles para ensayos de hibridación, como la detección de ARN en la transferencia de Northern o de ADN mediante la técnica de Southern. Se utilizan varios métodos de marcaje para distribuirlo por toda la sonda, como la PCR con desoxinucleótidos (dNTP) o trifosfatos de nucleótidos (NTP) marcados, cebado aleatorio y desplazamiento de mellas. El marcaje terminal es particularmente útil para investigar las interacciones entre ácidos nucleicos y proteínas con el fin de evitar el impedimento estérico.

Ensayos de marcaje y detección de los ácidos nucleicos

Dependiendo del método de marcaje, se utiliza detección colorimétrica para las sondas marcadas con enzimas o detección autorradiográfica cuando se han empleado sondas radiactivas. Entre las sondas habituales se cuentan la digoxigenina (DIG) y las sondas marcadas con fluoresceína, y pueden utilizarse en combinación para facilitar la detección multicolor de la sonda cuando se acopla a reacciones colorimétricas (por ejemplo, fosfatasa alcalina). De igual forma, también es posible la incorporación de biotín-16-dUTP utilizando PCR con la mayoría de las ADN polimerasas como otro método de marcaje y detección. En la hibridación fluorescente in situ (FISH) se utilizan sondas fluorescentes para detectar secuencias de ADN, y la detección satisfactoria y los análisis consecutivos vienen determinados en parte por la sensibilidad y la resolución del microscopio de fluorescencia del que disponga el investigador.

Aplicaciones del ADN y el ARN marcados

La transferencia de macromoléculas a membranas de fase sólida se conoce como transferencia a membrana o blotting. Debido a la especificidad de las sondas marcadas, la hibridación del ácido nucleico y la sonda proporciona a los investigadores la capacidad de detectar secuencias de ADN y de ARN en mezclas complejas de ácidos nucleicos. Además, estos métodos permiten recopilar más información valiosa, como el análisis de la expresión génica, el tamaño del ARNm y el número de copias dependiendo del ensayo. Los investigadores también suelen utilizar la hibridación in situ para detectar una o más sondas marcadas de manera diferente (por ejemplo, DIG y sondas marcadas con fluoresceína).


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