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Electroforesis en gel

Electroforesis en gel de proteínas Cámara de electroforesis en gel para desplazamiento de las proteínas en los geles

La electroforesis en gel de proteínas es una técnica habitual de separación de proteínas para su purificación, caracterización y análisis de expresión. En este enfoque, las moléculas de proteína cargadas son transportadas a través de un gel por un campo eléctrico. Su movilidad a través del campo eléctrico depende del tamaño, la forma y la carga de la proteína.

En la electroforesis de proteínas pueden utilizarse matrices de poliacrilamida y de agarosa. Esas matrices actúan como un tamiz permitiendo que las proteínas de menor tamaño se desplacen con más rapidez que las proteínas más grandes. La agarosa tiene un tamaño de poro grande y puede utilizarse para separar proteínas con un radio superior a 5-10 nm, como los complejos proteicos grandes. La poliacrilamida tiene un tamaño de poro menor, puede separar proteínas cuyo tamaño oscila entre 5 kDa y 2 000 kDa, y es la utilizada más a menudo en la electroforesis de proteínas.

Existen diversos métodos de electroforesis en gel de proteínas, cada uno de los cuales proporciona información clara de las proteínas de interés.


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SDS-PAGE

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato sódico (SDS) permite la separación de proteínas en función de su masa molecular. En este método, se incorpora el detergente SDS en un tampón de migración. El SDS imparte una carga negativa neta a las proteínas, enmascarando su carga intrínseca. A medida que las proteínas se separan en presencia de SDS y de reactivos desnaturalizantes, se vuelven menos globulares y más lineales. Como consecuencia, la velocidad a la que migran las proteínas unidas al SDS a través del gel depende principalmente de su tamaño, permitiendo estimar el peso molecular al compararlo con patrones proteicos.

PAGE nativa

En la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa, las proteínas se separan de una manera que preserva su conformación nativa (estructura terciaria), las interacciones entre las subunidades (estructura cuaternaria e interacciones proteína-proteínas) y la actividad biológica. En este método, las proteínas se preparan y se hacen correr bajo condiciones no reductoras y no desnaturalizantes. La motilidad de las proteínas se determina por una combinación compleja de factores: que cada proteína puede migrar hacia cualquiera de los electrodos dependiendo de su carga y a una velocidad que depende de su forma y su comportamiento de adsorción. Por esta razón, no se recomienda la PAGE nativa para la determinación del peso molecular. La PAGE nativa se utiliza normalmente en aplicaciones que requieren purificación de proteínas activas o detección por medio de un anticuerpo que reconoce sólo la forma nativa de la proteína.

Enfoque isoeléctrico (IEF)

En el enfoque isoeléctrico se utiliza un campo eléctrico y un gradiente de pH para separar las proteínas por su punto isoeléctrico (pI) nativo. Conforme las proteínas se desplazan por el gradiente de pH, se modifica su carga neta. En un campo eléctrico, cada proteína migra al pH en el cual su carga neta sea cero (lo que se conoce como punto isoeléctrico de la proteína). Durante el proceso de separación, las proteínas de la muestra se acumulan, o «enfocan», en zonas específicas y predecibles del gel. El enfoque isoeléctrico se utiliza en la identificación de las proteínas de muestras complejas (lisados celulares y tisulares, plasma), el análisis de las modificaciones postraduccionales y la separación de las muestras para análisis mediante espectrometría de masas.

PAGE 2D

La electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional permite la resolución de las proteínas en función de su punto isoeléctrico intrínseco (pI) y de su masa. La separación por pI se produce a través del enfoque isoeléctrico (IEF). La separación por masa ocurre mediante SDS-PAGE. La PAGE 2-D proporciona la mayor resolución para el análisis de proteínas, y se utiliza habitualmente en la investigación en proteómica para resolver de cientos a miles de proteínas en un único gel.