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normalphase or ion-exchange SPE. In other words, it may be difficult for a reversed-phase method or bonded chemistry to differentiate between molecules that are structurally similar. However, because reversed-phase will retain most molecules with any hydrophobic character, it is very useful for extracting analytes that are very diverse in structure within the same sample. ![Diagram illustrating the Reversed-Phase Solid Phase Extraction (SPE) Methodology. It depicts hydrophobic interactions between an aromatic compound with two benzene rings and a methoxy group (-OCH3) and the solvent functional group, symbolized by a zig-zagging chain. The red gradient background emphasizes the hydrophobic nature of these interactions, which are less selective compared to normal phase or ion-exchange SPE methods.](https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/analytical-chemistry/solid-phase-extraction/g003571/g003571.jpg "Aqueous Sample Matrix/Mobile Phase Environment") __Figure 1.__Aqueous Sample Matrix/Mobile Phase Environment Reversed-Phase SPE Retention Mechanism: Non-polar or hydrophobic interactions - Van der Waals or dispersion forces Sample Matrix: Aqueous samples - Biological fluids (serum, plasma, urine) - Aqueous extracts of tissues - Environmental water samples - Wine, beer and other aqueous samples Analyte Characteristics: Analytes exhibiting non-polar functionalities - Most organic analytes - Alkyl, aromatic, alicyclic functional groups Elution Scheme: Disrupt reversed-phase interaction with solvent or solvent mixtures of adequate non-polar character - Methanol, acetonitrile, dichloromethane - Buffer/solvent mixtures Common Applications: - Drugs and metabolites in biological fluids - Environmental pollutants in water - Aqueous extracts of tissues and solids ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Basic Steps 1. __Sample Pre-treatment:__ For interference laden samples (e.g., biological fluids), dilute samples 1:1 with buffer. pH manipulation may be important when dealing with ionizable compounds. A compound’s ionization state can drastically change its retention and elution characteristics on a given SPE sorbent. When an analyte is in its neutral form, it becomes more hydrophobic and retention strengthens under reversed-phase conditions. Adjusting the sample pH to 2 pH units above or below the compound’s pKa (depending on the functional group) will effectively neutralize the compound. When dealing with tissues and other solids, conduct a solid-liquid extraction or homogenization using a buffer. Solvents of non-polar character (including methanol and isopropanol) disrupt interaction between the compound and sorbent functional groups. To avoid clogging, it may be necessary to centrifuge, dilute, and/or pre-filter the sample prior to introducing it to the SPE phase. 2. __Conditioning/Equilibration:__ Conditioning wets or activates the bonded phases to ensure consistent interaction between the analyte and the sorbent functional groups. Reversed-phase sorbents are often conditioned with 1-2 tube volumes of a water miscible solvent such as methanol or acetonitrile. Equilibration introduces a solution similar to the sample load in terms of solvent strength and pH in order to maximize retention. 1-2 tube volumes of buffer (used in sample pre-treatment) or water are good choices for reversed-phase equilibration. 3. __Sample Load:__ Apply sample (from step 1) at a consistent and reduced flow rate of ~1-2 drops/second to ensure optimal retention. 4. __Wash:__ Sample interferences are often co-retained with compounds of interest during sample load. A wash step is necessary to elute interferences without prematurely eluting compounds of interest. 5-20% methanol in water or sample pre-treatment buffer is typical for wash solvents. 5. __Elution:__ Disrupt hydrophobic interactions between the analyte and sorbent functional groups with an organic solvent or solvent combination of sufficient non-polar character. Example elution solvents are 1-2 volumes of methanol or acetonitrile. pH manipulation during elution can often improve recovery when dealing with ionizable compounds. In their ionic form, basic and acidic compounds become more polar, weakening reversedphase interaction, possibly allowing for weaker elution solvents and/or reduced elution volumes. 6. __Eluate Post-treatment:__ It is often necessary to evaporate and reconstitute the SPE eluate in mobile phase prior to LC analysis. GC analysis often requires further SPE eluate concentration and/or possible matrix exchange with a more volatile solvent. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)SPE Tips 1. Drug-protein binding should be disrupted during sample pre-treatment. Strategies include: - 40 µL 2% disodium EDTA per 100 µL mouse plasma - 40 µL 2% formic acid per 100 µL mouse plasma - Other possible reagents (per 100 µL matrix): 40 µL 2% TCA, 40 µL 2% acetic acid, 40 µL 2% TFA, 40 µL 2% phosphoric acid, or 200 µL MeCN (protein ppt.). 2. If the SPE eluate needs to be evaporated prior to analysis, pass vacuum air through the SPE tube for~10 minutes after elution. This will remove residual moisture that may prolong evaporation. 3. Consistent and slow flow rate (1-2 drops per second) during sample load and elution will improve recovery and reproducibility. 4. Reduce bed weight to minimize elution volume. 5. Increase bed weight to retain more polar compounds. 6. Concern for sorbent over-drying is only critical during methanol conditioning. 7. A pre-conditioning solvent such as dichloromethane (or solvent used for elution) can be used before conditioning to remove any impurities on the SPE tube that can interfere with subsequent analysis. __Related Protocols__ - [Empowering Biochemists to Analyze Glycoproteins with Exceptional Reproducibility](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/large-molecule-hplc/bioshell-glycan-hplc-columns) - [Biological Testing for Amphetamine and Methamphetamine Abuse](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/biological-testing-for-amphetamine-and-methamphetamine-abuse) - [Accurate Biological Testing for Amphetamine and Methamphetamine Abuse Using Chiral HPLC and MS Detection](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/chiral-hplc-amphetamine-methamphetamine) - [UHPLC/MS for Drug Detection in Urine](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/small-molecule-hplc/uhplc-analysis-drugs-glucuronidase) - [Acrylamide in Food](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/solid-phase-extraction/acrylamide-in-food) - [Analysis of Melamine in Milk](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/solid-phase-extraction/analysis-of-melamine) - [Controlling SPE Selectivity Through pH and Organic Modifier Manipulation](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/solid-phase-extraction/controlling-spe-selectivity) - [Determination of Hydrocortisone from Topical Cream Using Discovery DSC-Si SPE and Reversed-Phase HPLC-UV](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/solid-phase-extraction/determination-hyrdocortisone-topical-cream) - [View More](https://www.sigmaaldrich.com/ES/en/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) Arriba __Inicie sesión para continuar.__ Para seguir leyendo, inicie sesión o cree una cuenta. 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Desarrollo. Producción.__ Somos un proveedor líder en la industria global de las ciencias de la vida, con soluciones y servicios para la investigación, el desarrollo y la producción biotecnológicos, y el desarrollo y la producción de terapias farmacológicas. [![Vibrant M string](https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/marketing/global/images/icons/vibrant-m-string-1-rrvcrp.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es) [SolucionesSigma-Aldrich®](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/life-science/sigma-aldrich)[SolucionesBio Reliance®](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/life-science/bioreliance)[Soluciones Millipore®](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/life-science/millipore)[SolucionesSAFC®](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/life-science/safc)[SolucionesMilli-Q®](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/life-science/milliq)[Soluciones Supelco®](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/life-science/supelco) © 2026 Merck KGaA, Darmstadt, Alemania y/o sus filiales. 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[Endonucleasa](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-formulation-raw-materials/endonuclease) - [Productos químicos de alta calidad para la fabricación de ARNm](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-formulation-raw-materials/high-quality-chemicals-for-mrna-manufacturing) - [Productos químicos para procesos upstream](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-formulation-raw-materials/upstream-process-chemicals) - [Cultivo celular para bioprocesamiento](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-cell-culture) - [Medios de cultivo celular para bioprocesamiento](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-cell-culture/bioprocessing-cell-culture-media) - [Líneas celulares para bioprocesamiento](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-cell-culture/bioprocessing-cell-lines) - [Medios y tampones líquidos para cultivos celulares para bioprocesamiento](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-formulation-raw-materials/liquid-cell-culture-media-buffers) - [Suplementos recombinantes para bioprocesamiento](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-cell-culture/recombinant-supplements) - [Bolsas para transporte de polvo a granel](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/custom-products/bulk-powder-transfer-bags) - [Retención celular](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-cell-culture/cell-retention) - [Medios de cultivo celular GMP personalizados](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/custom-products/custom-gmp-cell-culture-products) - [Filtración de medios](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/buffer-media-prep/media-filtration) - [Plataformas ascendentes de vectores virales](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/bioprocessing-cell-culture/viral-vector-upstream-platforms) - 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[Cromatografía de membrana](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/chromatography-bioprocessing/membrane-chromatography) - [Resinas de cromatografía de fase inversa/fase normal](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/chromatography-bioprocessing/reverse-normal-phase-chromatography) - [Resinas para cromatografía de exclusión por tamaño](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/chromatography-bioprocessing/size-exclusion-chromatography) - [Aclaración y recolección](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/clarification-harvest) - [Filtros de clarificación en profundidad y soluciones de pretratamiento](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/clarification-harvest/clarification-depth-filters-pretreatment-solutions) - [Soportes y sistemas para filtros de clarificación](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/clarification-harvest/clarification-filter-holders-and-systems-for-bioprocessing) - 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[Formulación](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation) - [PEG activados y funcionalizados](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/activated-functionalized-pegs) - [Formulación de biomoléculas](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/biomolecule-formulation) - [Materiales granulados](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/granulated-materials) - [Inyectables y formulaciones parenterales](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/injectables-parenteral-formulations) - [Formulación líquida](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/liquid-formulation) - [Estabilizadores de proteínas](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/products/pharma-and-biopharma-manufacturing/formulation/protein-stabilizers) - 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[Planes de mantenimiento y servicio](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/maintenance-and-service-plans) - [Sistemas de pruebas microbiológicas](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/maintenance-and-service-plans/microbiology-maintenance-and-service-plans) - [Planes de mantenimiento y servicioMilli-Q<sup>®</sup>](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/maintenance-and-service-plans/milli-q-services-plans-and-maintenance-for-water-purification-sy) - [Servicios del fotómetro Spectroquant<sup>®</sup>](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/maintenance-and-service-plans/spectroquant-photometer-services) - [Planes de confianza en el servicio del sistema](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/maintenance-and-service-plans/system-service-reliance-plans) - [Servicios y asistenciaMilli-Q<sup>®</sup>](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/milli-q-services-and-support) - [Planes de mantenimiento y servicio](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/maintenance-and-service-plans/milli-q-services-plans-and-maintenance-for-water-purification-sy) - [Cualificación y validación](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/systems-qualification/milliq-qualification-program) - [Calibración y verificación](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/calibration-and-verification/calibration-verification-suitability-testing-of-milli-q-water-pu) - [Servicios adicionales](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/milli-q-services-and-support/milli-q-additional-services) - [Servicios digitales MyMilli-Q™](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/software-and-digital-platforms/mymilli-q-digital-services) - [Servicio de predicción de cocristales mPredict™](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/m-predict-co-crystal-prediction-service) - [Servicios de validación de filtros y productos de un solo uso](https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/services/product-services/single-use-filter-validation) - 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