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Clonage et expression

Expression de protéines recombinantes dans des cellules de mammifères

Expression de protéines recombinantes dans des cellules de mammifères

Les technologies de clonage et d'expression génique sont utilisées dans divers domaines de la recherche pour explorer une multitude de questions de biologie, notamment pour comprendre la fonction des gènes, analyser les voies moléculaires, appréhender le développement embryonnaire, ainsi que dans la recherche sur les maladies et la bioproduction d'agents thérapeutiques et biologiques, entre autres. Une fois le gène ou la séquence génétique identifié, les chercheurs doivent identifier la meilleure stratégie de clonage moléculaire et le meilleur système d'expression en fonction des besoins de leur application. Pour plus d'informations sur l'utilisation de la technologie CRISPR dans l'expression génique ou l'utilisation des réactifs ARNi dans l'extinction génique, rendez-vous sur notre page Expression et extinction de gènes.


Articles techniques apparentés

  • The term “Restriction enzyme” originated from the studies of Enterobacteria phage λ (lambda phage) in the laboratories of Werner Arber and Matthew Meselson.
  • This cloning protocol includes selecting the cloning system and plasmid vector, plasmid restriction digestion, fragment restriction digestion, gel excision, dephosphorylating DNA and more.
  • Transfection is the introduction of DNA, RNA, or proteins into eukaryotic cells and is used in research to study and modulate gene expression. Thus, transfection techniques and protocols serve as an analytical tool that facilitates the characterization of genetic functions, protein synthesis, cell growth and development.
  • The 3xFLAG system is an improvement upon the original system by fusing 3 tandem FLAG® epitopes for a total of 22 amino acids. Detection of fusion proteins containing 3xFLAG is enhanced up to 200 times more than any other system.
  • For best results, ligation reactions must be heat inactivated at 70ºC for 15 minutes before transformation. Alternately, the reactions may be purified.
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Protocoles apparentés

  • Restriction enzyme collection has been optimized for digestion using five unique buffers.
  • This page describes the characteristics of pGEX expression vectors used with Cytiva products.
  • The cloning process requires the ligation of linear DNA into a cloning vector. This ability to join fragments of DNA through recombinant technology is essential for many basic experiments in biotechnology.
  • Technical Article on competent cells. Transformation is a process by which some bacteria take up foreign genetic material (naked DNA) from the environment.
  • Dephosphorylation of DNA using Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, Shrimp Alkaline Phospha, Bovine Intestinal Alkaline Phosphatase
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Vecteurs d'expression protéique

Les plasmides ou vecteurs d'expression de protéines sont des morceaux d'ADN circulaires qui contiennent de nombreux éléments fonctionnels pour le clonage et l'expression de la protéine d'intérêt. Le choix du vecteur d'expression adapté dépend en partie du type de protéine, de l'organisme dans lequel elle sera exprimée, de l'application et des questions scientifiques que les chercheurs se proposent d'examiner. Le vaste éventail de vecteurs d'expression disponibles permet aux chercheurs de choisir les éléments de clonage, de sélection clonale et d'expression protéique qui conviennent le mieux à leur étude. Une fois la séquence génétique d'intérêt et le vecteur d'expression sélectionnés, les chercheurs utilisent généralement des nucléases pour couper le vecteur avec précision au niveau de sites spécifiques. Ils peuvent alors cloner la séquence d'intérêt en phase, et enfin, l'exprimer dans un organisme hôte. Les chercheurs utilisent souvent des cellules chimiocompétentes et une transformation bactérienne pour servir d'hôte aux plasmides d'ADN recombinant, car elles sont stables lorsqu'elles sont congelées à -70 °C.

Transfection des cellules

La transfection cellulaire consiste à introduire de l'ADN, de l'ARN ou des protéines dans des cellules eucaryotes. Les chercheurs disposent d'un arsenal de technologies physiques, chimiques et biologiques pour accomplir cette étape de la procédure d'expression des protéines. Les méthodes physiques (p. ex. électroporation) et chimiques (p. ex. phosphate de calcium, polyéthylèneimine, réactifs de lipofection) sont couramment utilisées par les chercheurs. Ces derniers disposent également de systèmes de transduction virale, notamment des vecteurs lentiviraux, oncorétroviraux et adénoviraux. Cependant, pour des raisons de biosécurité, l'utilisation de vecteurs viraux nécessite souvent des mesures de confinement et de contrôle supplémentaires.

Systèmes d'expression des protéines

Divers organismes sont utilisés par les chercheurs pour exprimer la protéine d'intérêt. Les bactéries sont souvent utilisées en raison de leur capacité à incorporer efficacement les vecteurs d'expression, à se multiplier rapidement et à produire de grandes quantités de protéine recombinante dans des conditions optimales. Toutefois, étant des organismes procaryotes, les bactéries ne sont pas capables de réaliser les modifications post-traductionnelles requises par certaines protéines. Les cellules eucaryotes, notamment les levures et les lignées de cellules de mammifères, permettent la modification post-traductionnelle des protéines et sont aussi couramment utilisées par les chercheurs. Le choix de la meilleure lignée cellulaire pour l'expression des protéines recombinantes et de la stratégie d'expression protéique dépend en grande partie des besoins propres à l'application, mais aussi des questions que les scientifiques se proposent d'examiner.