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Applications de réaction en chaîne par polymérase (PCR)

La RT-PCR suit ces étapes : isolement de l'ARN ou de l'ARNm, hybridation de l'amorce, synthèse du premier brin et amplification par PCR

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une puissante technique de base de la biologie moléculaire qui constitue une méthode in vitro efficace et rapide pour l'amplification enzymatique de séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques provenant de diverses sources. Une PCR classique comprend un ADN cible, un jeu d'amorces oligonucléotidiques de synthèse encadrant la séquence d'ADN cible, une ADN polymérase thermostable (généralement une Taq polymérase) et des nucléotides. Chaque cycle d'amplification, réalisé avec un thermocycleur, comporte trois étapes : la dénaturation de l'ADN double brin (ADNdb) en simples brins séparés, l'hybridation des amorces sur la séquence d'ADN cible et l'extension des amorces, où l'ADN polymérase allonge l'ADN des amorces, créant un nouvel ADNdb constitué d'un ancien brin et d'un nouveau brin. Les brins synthétisés lors d'un cycle servent de matrice dans le cycle suivant, si bien que la quantité d'ADN est multipliée par un million en à peine 20 cycles.

PCR après transcription inverse (RT-PCR)

La RT-PCR, ou PCR après transcription inverse, est une variante de la technique de PCR classique qui consiste à amplifier un ARNm spécifique obtenu à partir de très petits échantillons. Elle permet de s'affranchir du fastidieux processus de purification de l'ARNm pourtant obligatoire pour les techniques de clonage traditionnelles. Avec la RT-PCR, une transcriptase inverse et un échantillon d'ARN sont utilisés en plus des réactifs de PCR classiques. Le mélange réactionnel est chauffé à 37 °C, ce qui permet la production d'une copie d'ADN complémentaire (ADNc) à partir de l'échantillon d'ARN par la transcriptase inverse. Cet ADNc s'hybride ensuite sur l'une des amorces, entraînant la synthèse du premier brin. À partir de là, on retrouve les étapes de la PCR classique, dont le produit final sera l'ADNdb. La RT-PCR est souvent associée à la PCR en temps réel (qPCR), qui est très utilisée pour la quantification des niveaux de transcription dans les cellules et les tissus.

PCR à démarrage à chaud

La PCR à démarrage à chaud est une technologie qui inhibe la Taq polymérase Hot Start ou l'incorporation de dNTP modifiés pendant la mise en place de la réaction jusqu'à la survenue d'une étape de thermoactivation. Plusieurs méthodes permettent de bloquer l'activité de la polymérase Hot Start, notamment la modification chimique et les techniques utilisant un anticorps ou un aptamère.

PCR en point final pour l'amplification à haute fidélité de longues cibles

La PCR en point final ("endpoint PCR") est souvent utilisée pour détecter la présence de cibles et leur abondance relative à l'issue de la réaction. L'incorporation de facteurs supplémentaires qui présentent une activité correctrice permet de résoudre en partie le problème de limitation de la longueur des séquences (environ 5 kb) en PCR classique. La PCR à haute fidélité de longs fragments (LA-PCR pour "Long and Accurate PCR") inclut l'utilisation d'une seconde polymérase thermostable à activité 3'→5' exonucléase pour corriger les erreurs d'incorporation de nucléotides terminaux, ce qui se traduit par une augmentation significative de la fidélité et par la possibilité d'amplifier des ADN cibles mesurant jusqu'à 40 kb.


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