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Cytométrie en flux

Introduction à la cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technologie qui utilise un ou plusieurs lasers pour réaliser une analyse multiparamétrique sur des cellules individuelles. Chaque cellule ou particule est analysée par diffusion de la lumière visible ou par fluorescence lorsqu'elle passe rapidement devant chaque laser. Indépendamment de l'analyse de la diffusion de la lumière, les mesures de fluorescence sont réalisées par transfection et expression de protéines fluorescentes courantes (par exemple, la protéine fluorescente verte ou GFP) et par coloration avec des anticorps conjugués ou des colorants fluorescents. La cytométrie en flux est une technologie puissante qui est couramment utilisée dans les applications de la recherche en biologie moléculaire et cellulaire, notamment en immunologie, en biologie du cancer et dans la recherche sur les maladies.


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Protocoles apparentés


Anticorps et marqueurs de cytométrie en flux

Une analyse par cytométrie en flux nécessite divers anticorps et marqueurs. Les anticorps de cytométrie en flux se fixent spécifiquement à différents marqueurs cellulaires, ce qui facilite la caractérisation du type de cellule et l'évaluation des modifications de l'expression des protéines dans le cadre de l'expérience. En fonction de la méthodologie expérimentale, de nombreux types de marqueurs peuvent être utilisés pour visualiser les anticorps et ainsi assurer la détection durant la cytométrie en flux, notamment des colorants d'acides nucléiques, des colorants de viabilité cellulaire, des colorants polymères, des points quantiques, de petites molécules organiques et des protéines fluorescentes. Les anticorps sont typiquement marqués par conjugaison directe (soit sous forme de produits disponibles dans le commerce, soit avec des kits de conjugaison permettant à l'utilisateur final de réaliser la réaction), ou via l'emploi d'anticorps secondaires. Une nouvelle technologie brevetée de cytométrie en flux permet à l'utilisateur final de mélanger et d'assortir de manière flexible et indépendante les anticorps et les marqueurs sélectionnés afin de les assembler de la manière qui lui plaît, sans avoir besoin de kits de conjugaison ou d'anticorps secondaires.

Applications de la cytométrie en flux

De nombreux domaines d'étude utilisent la cytométrie en flux et analysent souvent plusieurs paramètres au sein de diverses populations de cellules. Les applications courantes de la biologie moléculaire comprennent l'analyse de protéines fluorescentes exprimées par recombinaison dont l'expression a été induite dans différents types de cellules afin d'élucider la fonction des gènes ou pour le suivi in vivo des cellules. Si la coloration de l'ADN permet l'analyse du cycle cellulaire, l'utilisation d'anticorps permet une multitude d'analyses, notamment la transduction des signaux, l'ARN et l'expression des protéines. Cependant, l'immunophénotypage est l'une des applications les plus courantes de la cytométrie en flux. Dans le cas de l'immunophénotypage, des anticorps conjugués à des fluorochromes ciblent de multiples antigènes de surface cellulaire pour identifier des cellules immunitaires spécifiques au sein d'une population de cellules.

Analyse des données de cytométrie en flux

L'analyse des données de cytométrie en flux implique souvent l'identification d'une région spécifique de cellules ou d'un groupe de cellules et l'application de paramètres supplémentaires dans le cadre de l'expérience, y compris la recherche de facteurs supplémentaires d'identification des cellules, afin de mieux comprendre l'identité cellulaire. Il existe une multitude de logiciels qui sont couramment utilisés pour faciliter ce type d'analyse de données ainsi que d'autres analyses du cycle cellulaire.

Instruments de cytométrie en flux

Les principaux composants utilisés dans les cytomètres en flux sont : l'électronique, l'optique et la fluidique. La fluidique est le système d'acheminement du liquide qui dirige l'échantillon vers les composants optiques, composés d'un bloc optique d'excitation (laser) et d'un bloc optique de collecte constitué de photodiodes et de tubes photomultiplicateurs (PMT). Il est important de noter que les composants électroniques convertissent les informations provenant des détecteurs en signaux numériques qui sont interprétés par des ordinateurs. L'utilisation conjointe de systèmes supplémentaires permet d'effectuer des analyses plus avancées, notamment l'utilisation de trieurs de cellules pour purifier et collecter les échantillons et l'utilisation de cytomètres imageurs qui combinent la cytométrie en flux et la microscopie à fluorescence.