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Analyses par western blotting

Laboratoire d'analyses par western blotting. Technique de western blotting pour la détection de protéines.

Le western blotting est une technique reconnue de détection, d'analyse et de quantification des protéines. Cette méthode est largement utilisée pour détecter des molécules protéiques spécifiques dans des échantillons complexes tels que les homogénats de tissus et les lysats cellulaires. La technique de western blotting consiste généralement à séparer les protéines par électrophorèse sur gel, puis à les transférer sur une membrane en poly(fluorure de vinylidène) (PVDF) ou en nitrocellulose. Après avoir été transférées, les protéines peuvent être colorées pour être visualisées et directement identifiées par séquençage N-terminal, spectrométrie de masse ou immunodétection. 

Dans l'immunodétection par western blotting, les protéines sont identifiées par leur liaison à des anticorps spécifiques. En général, un anticorps primaire est utilisé en combinaison avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort ou à une phosphatase alcaline en vue d'une détection par chimiluminescence ou par colorimétrie à l'aide d'un substrat approprié. Un anticorps primaire ou secondaire marqué par fluorescence peut également être utilisé pour une visualisation directe.


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La technique du western blotting est largement utilisée en biochimie pour détecter la présence de protéines spécifiques, pour déterminer l'ampleur des modifications post-traductionnelles, pour vérifier l'expression des protéines dans les applications de clonage, pour analyser le niveau d'expression des protéines et des biomarqueurs, dans la cartographie des épitopes des anticorps et pour tester des marqueurs de maladie en conditions cliniques.

Face à la nécessité d'analyser simultanément un plus grand nombre de protéines dans des échantillons limités, des recherches ont été entreprises pour améliorer la sensibilité et la rapidité des techniques de transfert sur membrane. Le double blotting élimine les faux positifs dus à des interactions non spécifiques. Le far-western blotting permet de détecter des interactions spécifiques entre les protéines. Le southwestern blotting est utilisé pour identifier les protéines qui interagissent avec des séquences d'ADN spécifiques. Le transfert multibandelettes ("multistrip blotting") augmente le débit tout en minimisant la variabilité entre deux analyses. De nouvelles technologies sont en cours de développement pour réduire les quantités de protéines nécessaires pour produire un signal et améliorer les capacités quantitatives des analyses par western blotting.


Workflow

Lyse cellulaire de protéines pour western blotting.

Extraction des protéines

Lorsque l'on travaille avec des cellules ou des tissus, les échantillons doivent être fragmentés afin d'isoler les protéines avant l'analyse. Les tampons de lyse et d'extraction utilisent des détergents pour briser les parois et les membranes cellulaires et libérer les protéines. Le tampon idéal doit être choisi en fonction du type d'échantillon et de la localisation subcellulaire de la protéine cible.

Cuve d'électrophorèse sur gel pour le traitement des gels de protéines.

L'électrophorèse de protéines sur gel permet de séparer et de distinguer les protéines avant leur transfert. Le mélange de protéines préparé passe sur un gel de polyacrylamide qui trie les protéines en fonction de leur poids moléculaire et de leur charge.

Transfert de protéines sur membrane en PVDF pour une détection à l'aide des techniques de western blotting.

Les protéines séparées par l'électrophorèse sur gel sont immobilisées par transfert sur une membrane en PVDF ou en nitrocellulose. Le transfert utilise un courant électrique pour faire passer les protéines du gel à la membrane (electroblotting).

Détection par western blotting d'une protéine cible à l'aide d'un anticorps primaire et d'un anticorps secondaire conjugué à la HRP avec substrat.

La protéine cible est détectée soit à l'aide d'un anticorps primaire utilisé conjointement avec un anticorps secondaire conjugué à de la peroxydase de raifort ou de la phosphatase alcaline et avec un substrat chimiluminescent ou colorimétrique approprié, soit à l'aide d'un anticorps primaire ou secondaire marqué par fluorescence.





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