Guide de dépannage pour la HPLC
Comment identifier, isoler et corriger les problèmes de HPLC les plus courants
Même si le développement de méthodes de HPLC s'est amélioré grâce aux avancées dans le domaine de la technologie des colonnes et de l'instrumentation, on peut quand même avoir des problèmes. Dans ce guide, nous vous proposons un moyen pour isoler, identifier et corriger de manière systématique un grand nombre de problèmes de HPLC typiques.
Que vous utilisiez un système modulaire ou une unité plus sophistiquée, les segments importants d'un système de HPLC restent les mêmes. Des problèmes affectant l'ensemble des performances du système peuvent se produire dans chacun des composants. Nous abordons ici certains problèmes courants. Leurs solutions sont présentées sous forme de tableaux faciles à suivre.
Isoler les problèmes de HPLC
Dans un système de HPLC, des problèmes peuvent survenir à beaucoup d'endroits. Il faut d'abord définir le problème, puis isoler son origine.
Utilisez le Tableau 1 pour déterminer le(s) composant(s) pouvant être à l'origine de la défaillance. Procéder par élimination permet généralement de localiser précisément la cause et de corriger le problème.
Envie de passer de la HPLC à la UHPLC ? Vous pouvez calculer les économies, en termes de gain de temps et de consommation de solvants, que vous pourriez faire en transférant vos méthodes à l'aide de notre Calculateur de transfert de méthodes de HPLC.
Comment éviter les problèmes liés à la phase mobile
Un manque de sensibilité, une élévation de la ligne de base, du bruit de fond, ou l'apparition de pics fantômes sur le chromatogramme peuvent souvent être attribués à la phase mobile. Les contaminants présents dans la phase mobile sont particulièrement gênants lors de gradients d'élution. La ligne de base peut s'élever et de faux pics peuvent apparaître au fur et à mesure de l'augmentation du niveau des éléments contaminés.
L'eau est la source de contamination la plus commune dans les analyses en phase inverse. Pour la formulation des phases mobiles, il convient de n'utiliser que de l'eau distillée ou déionisée de grande pureté. Plusieurs systèmes de déionisation courants peuvent néanmoins introduire des contaminants organiques dans l'eau. Pour éliminer ces contaminants, passez l'eau déionisée sur du charbon actif ou une colonne C18 préparative.
Utilisez des solvants, des sels, des réactifs d'appariement d'ions, et des modificateurs acides ou basiques de qualité HPLC uniquement. Nettoyer les solvants de qualité inférieure est chronophage, et il reste généralement malgré tout des contaminants à l'état de traces. Ces traces de contamination peuvent causer des problèmes avec un détecteur à fluorescence ou à ultraviolet de grande sensibilité.
Comme de nombreux tampons aqueux favorisent la croissance des bactéries ou des algues, il convient de préparer ces solutions de frais, et de les filtrer (avec un filtre de 0,2 µm ou de 0,45 µm) avant utilisation. Cette filtration permettra aussi de retirer les particules susceptibles de générer du bruit dans la ligne de base, ou de colmater la colonne. Pour éviter la prolifération des micro-organismes, ajoutez environ 100 ppm d'azoture de sodium aux tampons aqueux. Une autre solution consiste à mélanger ces tampons avec au moins 20 % d'un solvant organique tel que l'éthanol ou l'acétonitrile.
Pour éviter les bulles dans le système, dégazez la phase mobile. Le choix se porte généralement en premier sur un dégazeur en ligne, mais il est aussi possible d'injecter de l'hélium si la phase mobile ne contient aucun constituant volatil.
Utilisez les réactifs d'appariement d'ions avec précaution. Il est nécessaire de déterminer, pour chaque analyse, la longueur de chaîne et la concentration optimales du réactif. La concentration peut démarrer à 0,2 mM, et monter jusqu'à 150 mM voire plus. En général, l'accroissement de la concentration ou de la longueur de chaîne entraîne une augmentation des temps de rétention. Une forte concentration (> 50 %) d'acétonitrile ou de certains autres solvants organiques peut faire précipiter les réactifs d'appariement d'ions. De plus, certains sels des réactifs d'appariement d'ions sont insolubles dans l'eau et précipitent. Vous pouvez éviter cela en utilisant des tampons à base de sodium en présence d'acides sulfoniques à longue chaîne (dodécylsulfate de sodium par exemple), au lieu de tampons à base de potassium.
Les modificateurs acides ou basiques volatils, tels que la triéthylamine (TEA) et l'acide trifluoroacétique (TFA), sont utiles lorsque vous souhaitez récupérer un composé en vue d'une autre analyse. Ces modificateurs vous permettent aussi d'éviter les problèmes associés aux réactifs d'appariement d'ions. Ils peuvent être ajoutés au tampon à des concentrations de 0,1 à 1,0 % pour la TEA, et de 0,01 à 0,15 % pour le TFA. Accroître leur concentration peut améliorer la forme du pic de certains composés, mais peut altérer les temps de rétention.
Pour réduire le coût des solvants, leur élimination, et le temps de préparation de la phase mobile, le recyclage de la phase mobile utilisée dans les séparations isocratiques est de plus en plus populaire. Un appareil de recyclage des solvants utilise une vanne de commutation commandée par un microprocesseur pour diriger le flux de solvant vers le flacon à déchets lorsqu'un pic est détecté. Lorsque la ligne de base retombe en-dessous d'un seuil prédéfini, le solvant non contaminé est renvoyé vers le réservoir de solvant.
Figure A.Éléments constitutifs d'un système de HPLC
Isoler les problèmes liés à la pompe
La pompe doit délivrer un débit constant de solvant dans la colonne, et ce dans un large éventail de conditions. Les pompes de HPLC sont constituées d'un piston simple ou double, d'une seringue ou d'une membrane.
Les problèmes liés au système de pompage sont généralement faciles à identifier et à corriger. Des temps de rétention irréguliers, une ligne de base bruyante, ou des pics inattendus sur le chromatogramme constituent certains des signes les plus courants de ce type de problème. Les fuites au niveau des raccords ou des joints induisent une chromatographie de piètre qualité. L'accumulation de sels sur le raccord d'une pompe indique toujours la présence d'une fuite. Il est recommandé d'évacuer chaque jour les sels des tampons présents dans le système avec de l'eau déionisée préparée de frais. Pour isoler et réparer les problèmes spécifiquement liés à votre appareil, reportez-vous aux chapitres du manuel d'utilisation dédiés au dépannage et à la maintenance. Les joints des pompes doivent être remplacés régulièrement. Plutôt que d'attendre qu'un problème survienne, optez pour un entretien régulier.
Injecteur et solvants d'injection
L'injecteur permet d'introduire rapidement l'échantillon dans le système, tout en perturbant le moins possible l'écoulement du solvant. Les systèmes de HPLC actuels utilisent des injecteurs à boucle variable, à boucle fixe, ou de type seringue. Ceux-ci peuvent être activés de manière manuelle, pneumatique ou électrique.
Les problèmes mécaniques impliquant l'injecteur (fuites, capillaires bouchés, joints usés...) sont faciles à identifier et à corriger. Utilisez un filtre de précolonne pour prévenir le colmatage du fritté de la colonne dû à la dégradation physique du joint de l'injecteur. D'autres problèmes, comme les injections non reproductibles, sont plus difficiles à solutionner.
Les hauteurs de pics variables, les dédoublements de pic et les pics larges peuvent être dus à un remplissage incomplet de la boucle d'échantillonnage, à une incompatibilité entre le solvant d'injection et la phase mobile, ou à une mauvaise solubilité de l'échantillon. Dans la mesure du possible, dissolvez et injectez les échantillons dans de la phase mobile. Sinon, veillez à ce que le solvant d'injection ait une force éluante inférieure à celle de la phase mobile (Tableau 3). Gardez en tête que certains passeurs automatiques d'échantillons utilisent des seringues distinctes pour les solutions de lavage. Veillez à utiliser une solution de lavage compatible avec la phase mobile et moins forte que celle-ci. Ceci est particulièrement important en cas de transition entre une analyse en phase inverse et une analyse en phase normale.
Protection de la colonne
Bien qu'ils ne fassent pas partie intégrante de la plupart des équipements, les filtres d'injection de la phase mobile, les filtres de pré-injecteur et de précolonne, et les colonnes de garde permettent de considérablement réduire les problèmes associés aux séparations complexes. Nous recommandons de filtrer tous les échantillons avec des filtres pour seringue de 0,45 µm ou 0,2 µm. Nous recommandons aussi fortement d'utiliser des colonnes de garde.
Les filtres et les colonnes de garde empêchent les particules et les composés fortement retenus de s'accumuler dans la colonne analytique. La durée de vie utile de ces produits jetables dépend de la composition de la phase mobile, de la pureté des échantillons, du pH... La contamination ou le colmatage de ces dispositifs par des particules provoque une hausse de pression et un élargissement ou un dédoublement des pics. À titre d'exemple, la Figure B présente un cas typique prouvant l'utilité des colonnes de garde.
Figure B.Les colonnes Supelguard prolongent la durée de vie de vos colonnes analytiques
Tirez le maximum de votre colonne analytique
Que votre système de chromatographie soit de type phase normale ou inverse greffée, à échange d'ions, à affinité, à interactions hydrophobes, à exclusion stérique, ou rempli de résine ou de silice, le problème le plus fréquemment rencontré avec les colonnes analytiques est la détérioration. Cette détérioration se manifeste par une piètre forme de pic, un dédoublement des pics, des épaulements, une perte de résolution, une baisse des temps de rétention, et une forte contrepression. Ces signes indiquent une accumulation de contaminants sur le fritté ou à l'entrée de la colonne, ou la présente de vides, de canaux, ou d'une dépression dans le lit de remplissage.
La détérioration est plus facile à voir sur les colonnes de grande efficacité. Par exemple, un remplissage de 3 microns retenu par des frittés de 0,5 micron a davantage de risque de se colmater qu'un remplissage de 5 ou 10 microns retenu par des frittés de 2 microns ou plus. Protéger correctement la colonne et bien préparer les échantillons sont essentiels pour tirer le maximum de chaque colonne.
La saturation d'une colonne peut générer des formes de pics médiocres et d'autres problèmes.
Capacité d'une colonne
La capacité d'une colonne dépend de nombreux facteurs, mais la quantité totale d'analytes qu'elle peut typiquement traiter est donnée ci-dessous :
| Type de colonne | Dimensions de la colonne | Capacité de la colonne |
|---|---|---|
| Colonne analytique | 25 cm × 4,6 mm | < 500 μg |
| Colonnes semi-préparative | 25 cm × 10 mm | < 100 mg |
| Colonne préparative | 25 cm × 21 mm | < 500 mg |
Résoudre les problèmes liés au détecteur
Les problèmes liés au détecteur peuvent être de deux types : électriques et mécaniques/optiques. Pour les problèmes électriques, contactez le fabricant de l'instrument. Les problèmes mécaniques ou optiques, quant à eux, trouvent généralement leur source au niveau de la cellule. Les problèmes liés au détecteur englobent les fuites, les bulles d'air et la contamination de la cellule. Habituellement, ils entraînent une perte de sensibilité, ou produisent des pics fantômes ou du bruit dans la ligne de base sur les chromatogrammes.
Certaines cellules, en particulier celles utilisées dans les détecteurs réfractométriques, sont sensibles à la pression. Les débits et les contrepressions excédant la recommandation du fabricant provoquent la rupture de la fenêtre de la cellule. Les vieilles lampes défectueuses ainsi qu'un temps de réponse, un gain ou une atténuation du détecteur incorrects réduisent la sensibilité et la hauteur de pic. Des connexions électriques inversées ou défaillantes peuvent aussi causer des problèmes.
Système de chauffage de la colonne, enregistreur
Ces composants sont rarement source de problèmes. Ils sont traités dans le tableau de dépannage (Tableau 1).
Conserver des données précises
La plupart des problèmes ne surviennent pas du jour au lendemain : ils prennent forme graduellement. Il est donc crucial, pour pouvoir détecter et résoudre un grand nombre de problèmes, de conserver des données précises.
Inspectez chacune des colonnes que vous recevez, à la livraison puis à intervalles réguliers. En conservant par écrit l'historique de l'efficacité de la colonne, des phases mobiles utilisées, du courant de la lampe, des performances de la pompe, etc., vous pourrez suivre les performances de votre système.
Ces données permettent aussi d'éviter les erreurs, telles que l'introduction d'eau dans une colonne de silice, ou la précipitation d'un tampon dans le système par ajout d'une quantité excessive de solvant organique. Bon nombre d'analystes modifient leurs systèmes de HPLC d'une façon ou d'une autre. Garder la trace de ces modifications est le meilleur moyen pour s'assurer qu'elles ne génèrent pas de problème. Pour les problèmes liés aux pompes, aux détecteurs, aux passeurs automatiques d'échantillons et aux systèmes de données, consultez le guide de dépannage du manuel l'instrument.
Index des problèmes rencontrés en HPLC
| Problème | N° du problème |
| dérive de la ligne de base | 12 |
| bruit, irrégulier | 14 |
| bruit, régulier | 13 |
| Contrepression de la colonne | |
| supérieure à d'habitude | 4 |
| inférieure à d'habitude | 3 |
| pics fantômes | 19 |
| Forme des pics, incorrecte | |
| pics larges | 15 |
| pics élargis sur l'avant | 10 |
| pics arrondis | 11 |
| dédoublement des pics | 7 |
| traînées de pic | 8 |
| traînées de pic, au début et par la suite | 9 |
| Pics | |
| variation de hauteur | 16 |
| disparition de pics | 2 |
| pics négatifs | 18 |
| absence de pics | 1 |
| pics non résolus | 6 |
| temps de rétention, variables | 5 |
| modification de la sélectivité | 17 |
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°2 : Débit nul
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°3 : Pression nulle/inférieure à d'habitude
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°4 : Pression supérieure à d'habitude
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°5 : Temps de rétention variables
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°6 : Perte de résolution
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°7 : Dédoublement des pics
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°8 : Traînées de pic lors de la première injection et des suivantes
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n° 9 : Traînées de pic
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°10 : Pics élargis sur l'avant
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°11 : Pics arrondis
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°12 : Dérive de la ligne de base
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°13 : Bruit dans la ligne de base (régulier)
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°14 : Bruit dans la ligne de base (irrégulier)
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°15 : Pics larges
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°16 : Variation de la hauteur de pic (d'un ou plusieurs pics)
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°17 : Modification de la sélectivité
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Problème n°18 : Pic(s) négatif(s)
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
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Problème n°19 : Pic fantôme
| Problème | Cause probable | Solution/Commentaires |
|---|---|---|
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Autres recommandations
Nous vous suggérons aussi de vous reporter aux sections relatives à la maintenance et à la résolution des anomalies du manuel de votre instrument. Les systèmes de HPLC modernes possèdent souvent des fonctionnalités d'auto-diagnostic qui facilitent l'identification de la zone défaillante au sein de l'instrument. En cas de problèmes persistants vis-à-vis de la colonne ou de votre analyse en particulier, veuillez contacter le Service technique de Supelco.
Les pages suivantes de ce guide contiennent des procédures permettant de restaurer les performances de la colonne suite à une perte de résolution, de rétention ou de sélectivité, des suggestions sur la façon de prévenir et de résoudre les problèmes matériels liés aux colonnes, ainsi qu'une sélection de produits tirés du catalogue Supelco pour protéger les colonnes. Consultez notre catalogue pour découvrir notre gamme complète d'accessoires qui prolongent la durée de vie des colonnes et, de manière générale, simplifier ou améliorer vos analyses par HPLC ou FPLC®.
Pour finir, vous pouvez nous joindre par téléphone pour demander de la documentation complémentaire sur nos produits de HPLC et FPLC, ou utiliser notre service ChromFax pour accéder immédiatement à l'ensemble de nos publications techniques gratuites.
Restaurer les performances de votre colonne
Les procédures suivantes permettent de rajeunir les colonnes dont les performances se sont détériorées en raison d'une contamination due aux échantillons.
Déconnecter la colonne et l'installer en sens inverse. La connecter à la pompe, mais pas au détecteur. Appliquer la procédure de rinçage appropriée du tableau ci-dessous, en utilisant un débit permettant d'atteindre une contrepression de colonne de 1500-4500 psi, mais en aucun cas supérieure à la pression maximale recommandée dans le manuel d'instructions du fabricant. Si vous possédez une colonne SUPELCOSIL, utiliser le mélange test et les conditions indiquées dans la fiche technique. L'efficacité, la symétrie et la capacité doivent correspondre à +/- 10-15 % des valeurs figurant dans la fiche de test. Si ce n'est pas le cas, remplir à nouveau l'entrée de la colonne ou remplacer la colonne.
Remarque : les volumes indiqués dans le Tableau 2 concernent les colonnes de 25 cm x 4,6 mm de d.i., d'un volume de 4,15 ml. Lors de la restauration d'une colonne de 4,6 mm de d.i. et d'une longueur autre que 25 cm, multiplier tous les volumes du Tableau 2 par le rapport entre la longueur réelle de la colonne et une longueur standard de 25 cm (par exemple, pour une colonne de 15 cm : utiliser un rapport de 15/25, soit 0,6 fois les volumes du Tableau 2). Lors de la restauration d'une colonne d'un diamètre intérieur autre que 4,6 mm, multiplier tous les volumes du Tableau 2 par le rapport entre le carré du d.i. de la colonne et (4,6)2 (par exemple, pour une colonne de 3,2 mm de d.i. : utiliser un rapport de (3,2)2/(4,6)2 = 10,24/21,16, soit 0,48 fois les valeurs du Tableau 2).
Colonne de silice Rincer avec ce qui suit :
Évaluer les performances de la colonne dans les conditions spécifiées par le fabricant. Remarque : voir aussi la solution de régénération pour colonnes de silice pour rajeunir une colonne de silice désactivée.
| Colonne SUPELCOSIL LC-PCN A. Pour éliminer les protéines B. Pour éliminer le TCA
Si les performances de la colonne ne sont toujours pas acceptables, préparer le tampon de la phase mobile à 10x la concentration utilisée pour les analyses, et faire recirculer dans la colonne toute une nuit*. * Attention : avec certains types et/ou concentrations de tampon, multiplier la concentration par 10 peut provoquer une précipitation. |
Colonnes en phase inverse à base de silice (colonnes alkyle (C8, C18, etc.), phényle, ou diphényle, colonne SUPELCOSIL LC-PAH) A. Échantillons solubles dans l'eau - Rincer avec ce qui suit :
Évaluer les performances de la colonne. B. Échantillons non solubles dans l'eau - Rincer avec ce qui suit :
Évaluer les performances de la colonne.
| Colonnes échangeuses d'ions à base de silice (échange d'anions ou de cations forts ou faibles) La plupart des analyses impliquant des systèmes d'échange d'ions utilisent des phases mobiles ioniques. Les composés susceptibles d'affecter les performances de la colonne sont généralement insolubles ou très peu solubles dans l'eau. La procédure suivante devrait permettre d'éliminer ces composés. Rincer avec ce qui suit :
Évaluer les performances de la colonne. |
| Colonnes avec phase greffée polaire (colonnes amino, cyano ou diol, ou colonnes chirales du type Pirkle) Pour une colonne utilisée en mode phase inverse (avec une phase mobile du type solvant organique/tampon aqueux par exemple), suivre la même procédure de nettoyage que pour les colonnes en phase inverse à base de silice. Pour une colonne utilisée avec des phases mobiles non aqueuses, suivre la procédure suivante : Rincer avec ce qui suit :
Évaluer les performances de la colonne. | Colonnes à base de silice pour la RPLC de protéines et de peptides Suivre le protocole applicable aux colonnes en phase inverse à base de silice. Sinon, procéder à une ou plusieurs injections de 100 µl de trifluoroéthanol (déterminer le nombre d'injections en évaluant les performances de la colonne après chaque injection). Évaluer les performances de la colonne. |
| Solvant | Polarité | Miscible à l'eau ? | Coupure UV • | Indice de réfraction à 20 °C | Force du solvant ∈o (silice) | Viscosité à 20 °C, cP |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Hexane | non polaire | non | 200 | 1,375 | 0 | 0,33 |
| Isooctane | ↓ | non | 200 | 1,391 | 0,01 | 0,5 |
| Tétrachlorure de carbone | ↓ | non | 263 | 1,4595 | 0,14 | 0,97 |
| Chloroforme | ↓ | non | 245 | 1,446 | 0,31 | 0,57 |
| Chlorure de méthylène | ↓ | non | 235 | 1,424 | 0,32 | 0,44 |
| Tétrahydrofurane | ↓ | oui | 215 | 1,407 | 0,35 | 0,55 |
| Éther diéthylique | ↓ | non | 215 | 1,353 | 0,29 | 0,23 |
| Acétone | ↓ | oui | 330 | 1,359 | 0,43 | 0,32 |
| Acétate d'éthyle | ↓ | très peu | 260 | 1,372 | 0,45 | 0,45 |
| Dioxane | ↓ | oui | 215 | 1,422 | 0,49 | 1,54 |
| Acétonitrile | ↓ | oui | 190 | 1,344 | 0,5 | 0,37 |
| Propan-2-ol | ↓ | oui | 210 | 1,377 | 0,63 | 2,3 |
| Méthanol | ↓ | oui | 205 | 1,329 | 0,73 | 0,6 |
| Eau | polaire | oui | –– | 1,3328 | > 0,73 | 1 |
Colonnes de silice non greffée exposées à un solvant polaire
Les échantillons et les phases mobiles contenant des solvants très fortement polaires (eau ou alcools par exemple) peuvent désactiver les colonnes de HPLC remplies de silice non protégée. Cela peut avoir un effet considérable sur les performances de la colonne, en particulier sur la rétention des solutés et la sélectivité (Figure C2). Même un rinçage prolongé de la colonne avec un solvant non polaire, qui par ailleurs gaspille des produits, ne peut restaurer que partiellement les performances de la colonne. Une solution de régénération de silice permet de restaurer rapidement et à moindre coût les performances des colonnes à base de silice, en éliminant les substances polaires qui y sont piégées. Pomper la solution dans la colonne affectée pendant 10 minutes à un débit de 4 ml/minute, puis rincer avec de la phase mobile pendant 10 minutes à un débit de 2 ml/minute. Évaluer les performances de la colonne en utilisant le mélange test destiné aux colonnes de silice (réf. 58281). Les performances doivent être pratiquement les mêmes qu'avant l'introduction du solvant polaire (Figure C3).
Solution de régénération pour colonne de silice, 200 ml (réf. 33175)
Figure C.La solution de régénération restaure les performances des colonnes de silice
Mélanges test pour colonnes
Mélanges pour l'évaluation des performances des colonnes de HPLC.
Les mélanges test, parfaitement définis, vous permettent de résoudre les problèmes chromatographiques, d'optimiser l'efficacité du système, et d'évaluer les colonnes dans des conditions où leurs performances sont bien comprises. Nos mélanges test sont expédiés dans des ampoules de couleur ambrée pour éviter la photodégradation, et sont accompagnés d'instructions pour utiliser et interpréter correctement les résultats.
Les mélanges sont proposés en fonction de la colonne utilisée ou de l'application. Consultez notre catalogue pour voir notre sélection complète de mélanges test, ou appelez notre Service technique.
Prévenir et résoudre les problèmes matériels courants
Prévenir les fuites
Les fuites sont un problème courant en HPLC. Pour réduire autant que possible les fuites dans votre système, évitez d'intervertir du matériel et des raccords de fabricants différents. Il est possible de connecter des raccords incompatibles en forçant, mais leur séparation peut s'avérer problématique et les connexions répétées peuvent avec le temps provoquer des fuites au niveau des raccords. Si vous devez absolument intervertir du matériel, utilisez des adaptateurs appropriés et vérifiez l'absence de fuite sur toutes les connexions avant de passer à l'étape suivante.
Les sels fortement concentrés (> 0,2 M) et les phases mobiles caustiques peuvent réduire l'efficacité des joints de la pompe. La durée de vie des joints de rotor d'injecteur dépend également des conditions de la phase mobile, en particulier du fonctionnement à pH élevé. Dans certains cas, l'utilisation prolongée de réactifs d'appariement d'ions a un effet lubrifiant sur les pistons de la pompe, susceptible de produire de petites fuites au niveau du joint. Certains joints ne se comportent pas bien en présence de certains solvants. Avant d'utiliser une pompe dans des conditions défavorables, lisez les spécifications de l'instrument. Pour remplacer les joints, reportez-vous à la section du manuel de la pompe dédiée à la maintenance.
Déboucher le fritté de la colonne
Le colmatage du fritté de la colonne est un autre problème courant en HPLC. Pour réduire autant que possible ce problème dès le départ, utilisez un filtre de précolonne et une colonne de garde.
Pour nettoyer la zone d'injection, commencez par déconnecter la colonne puis installez-la en sens inverse. Connectez-là à la pompe (mais pas au détecteur), et pompez du solvant à un débit deux fois plus élevé que la normale. Environ 5-10 volumes de colonne devraient suffire à déloger les petites quantités de particules logées sur le fritté d'injection. Évaluez les performances de la colonne nettoyée à l'aide d'un mélange test étalon.
Remplacer le fritté à l'entrée de la colonne
Parfois, ni les procédures de rinçage au solvant (voir ci-dessus), ni les procédures de restauration (Tableau 2) ne permettent de retrouver les performances d'origine d'une colonne. Si vous avez déterminé que la colonne est bien à l'origine du problème, et si les autres procédures de restauration ont échoué, il se peut qu'il y ait un espace vide dans le remplissage, ou bien une obstruction persistante dans le fritté d'injection.
En dernier recours, ouvrez l'extrémité d'injectionde la colonne. Attention : ouvrir l'extrémité d'injection, et plus encore l'extrémité de sortie, peut endommager de manière permanente le lit de remplissage. Avant d'ouvrir une colonne, consultez la documentation du fabricant (n'ouvrez jamais les extrémités d'une colonne remplie de résine).
Utilisez la procédure suivante pour ouvrir une colonne.
- Déconnecter la colonne du système. Pour empêcher le remplissage de sortir de la colonne, effectuer les étapes suivantes aussi vite que possible.
- À l'aide d'un étau et d'une clé, ou de deux clés, retirer avec prudence le raccord de l'extrémité d'injection (Figure D). Si le fritté reste dans le raccord, le déloger en tapotant le raccord sur une surface dure. Si le fritté reste sur la colonne, le faire glisser au lieu de le soulever. Ceci contribuera à préserver l'intégrité du lit de remplissage.
Les colonnes modulaires peuvent nécessiter un outil spécial (réf. 55216) pour retirer le capuchon du fritté. - Examiner l'ancien fritté. La compression du fritté contre le tube en acier inoxydable laisse un anneau autour du bord côté colonne d'un fritté correctement positionné. L'absence d'anneau peut signifier que la ferrule est située trop près de l'extrémité du tube. La connexion lâche qui en résulte peut générer des fuites de silice ou se comporter comme une chambre de mélange.
- Examiner le lit de remplissage. S'il est enfoncé ou fracturé, la colonne doit être changée.
- Replacer le fritté.
- Replacer le raccord d'extrémité. Le serrer à la main, puis le serrer d'1/4 de tour supplémentaire à l'aide d'une clé.
Figure D.Structure typique des colonnes de HPLC
Protégez votre instrument et vos colonnes en éliminant les particules et les gaz présents dans les solvants et autres constituants de la phase mobile. Les filtres membranes en nylon 66 sont compatibles avec tous les solvants couramment rencontrés en HPLC.
Appareil de filtration 1
(à relier à une fiole à bras latéral de 1000 ml)
Inclut un réservoir en verre de 250 ml, une base d'entonnoir et un bouchon, une pince, un support et une grille en acier inoxydable, 10 joints en Téflon, et 50 filtres en nylon 66 (47 mm, pores de 0,45 μm).
Appareil de filtration 2
(à relier à la ligne d'aspiration)
Inclut un réservoir en verre de 250 ml, une base d'entonnoir conique 34/45, une fiole de 1000 ml avec joint rodé 34/45 et un bouchon en verre, une pince, un support et une grille en acier inoxydable, 10 joints en Téflon, et 50 filtres en nylon 66 (47 mm, pores de 0,45 μm).
Appareil de filtration de phase mobile Supelco®
Response not successful: Received status code 500
Pièces de rechange en verre
Response not successful: Received status code 500
Filtres
Il est essentiel d'installer un filtre de précolonne pour protéger les colonnes de HPLC contre les particules qui peuvent s'accumuler sur le fritté de la colonne, et générer des dédoublements de pics et une forte contrepression. Les particules peuvent provenir des phases mobiles (notamment quand des tampons sont mélangés à des solvants organiques), des joints de la pompe et de l'injecteur, et des échantillons. Utilisez un fritté de 2,0 μm pour protéger les colonnes contenant des particules de 5 μm ou plus, ou un fritté de 0,5 μm pour les colonnes remplies de particules de moins de 5 μm.
Filtre Supelco
Du type Direct Connect ; protège les colonnes analytiques et de garde.
Notre filtre de précolonne peut être connecté directement et serré à la main sur n'importe quelle colonne de HPLC ou colonne de garde figurant dans notre catalogue actuel, ou sur n'importe quelle autre colonne possédant des raccords d'extrémité compatibles avec les systèmes Valco. Bouchon et corps en PEEK, fritté de 2 µm en acier inoxydable. Pour un système sans métaux, commandez des frittés de rechange en PEEK/Téflon (réf. 57430-U).
Filtres Supelco®
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Fritté de précolonne et filtres écrans Valco3
Installation en ligne. Particulièrement efficaces, ces filtres à faible volume mort protègent vos colonnes contre les particules sans réduire leurs performances. Le fritté remplaçable de 1/8" a des pores de 0,5 μm pour protéger les remplissages de colonne de 3 μm ou 5 μm ; le filtre écran remplaçable, quant à lui, a des pores de 2 μm. Choisissez le filtre fritté pour une plus grande capacité de filtration (pour la plupart des applications) ou le filtre écran pour un volume mort réduit (avec les colonnes du type microbore par exemple). À utiliser avec un tube de 1/16" de diamètre extérieur ; raccords de 1/16" inclus.
Filtres et frittés de précolonne Valco
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Filtre de précolonne Isolation Technologies
Installation en ligne. Ce filtre d'injection de grande capacité réduit au minimum le volume mort et l'élargissement des bandes, pour éviter à votre colonne de perdre en efficacité tout en la protégeant. Porosité du fritté : 0,5 µm. Fourni complet, comme indiqué.
Filtre de précolonne haute pression SSI
Installation en ligne. Le disque filtre en acier inoxydable 316 (avec des pores de 0,5 μm) peut être facilement remplacé sans avoir besoin de retirer le raccord d'extrémité de la colonne. Pression de service maximale : 15 000 psi (1054 kg/cm²). Pour tube de 1/16".
Filtre de pré-injecteur haute pression SSI
À placer entre la pompe et l'injecteur, pour assurer la filtration finale de la phase mobile. Élément filtrant en acier inoxydable 316 (avec des pores de 0,5 μm) facile à remplacer. Pression de service maximale : 15 000 psi (105 MPa). Pour tube de 1/16" de diamètre extérieur, filetage 10-32.
Filtres de précolonne Isolation Technologies
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Filtre de précolonne Upchurch
Installation en ligne. Corps en acier inoxydable avec raccords d'extrémité inertes en polyétheréthercétone (PEEK), dont l'un est équipé d'un fritté de 0,5 μm ou
2 μm en PEEK.
Filtres de précolonne Upchurch
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Injecteurs Rheodyne 7725 et 7725i
Le modèle d'injecteur 7725 de Rheodyne vous permet d'injecter des échantillons de 1 μl à 5 ml avec exactitude et précision. Sa structure robuste et facile à entretenir offre de nombreuses fonctionnalités avancées :
- Système à circulation continue breveté (voir la figure) : l'écoulement ne s'interrompt pas lorsque vous passez de CHARGER à INJECTER.
- Ajustement aisé du joint à l'aide d'une vis de pression sur l'avant de l'injecteur.
- Grand angle inter-voies (30°), pour un accès facile aux raccords.
L'injecteur comprend une boucle d'échantillonnage de 20 μl et est fourni avec un joint de rotor en VESPEL qui peut être remplacé par un joint de rotor en Tefzel pour les utilisations à pH 0-14. Réglé en usine à 5000 psi (345 bar), ajustable jusqu'à 7000 psi (483 bar). Le modèle 7725i possède un contacteur de position interne.
Le modèle d'injecteur 7725 réduit l'usure normale de vos colonnes
Une vanne de HPLC conventionnelle interrompt momentanément l'écoulement durant l'injection de l'échantillon, soumettant votre colonne à des chocs de pression à répétition. La structure MBB ("make-before-break") brevetée de Rheodyne établit la nouvelle connexion avant de stopper l'ancienne, ce qui assure un flux ininterrompu.
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Pièces de rechange pour pompe Optimize Technologies
Un programme de maintenance préventive assurant le remplacement en routine des pièces de votre pompe sensibles à l'usure vous évitera des arrêts coûteux. Notre vaste sélection de clapets anti-retour, de joints et de pistons Optimize Technologies respecte voire dépasse les spécifications des fabricants de pompes. Pour découvrir notre sélection la plus récente de pièces pour pompes, consultez le catalogue Supelco, ou appelez notre Service technique.
Amortisseur de pulsations SSI LO-Pulse
Un amortisseur de pulsations contrôle les pulsations de la pompe pour donner une ligne de base plus stable. L'amortisseur SSI LO-Pulse est un système breveté compatible avec les pompes alternatives de HPLC à simple piston (pompe Altex 110A, pompes Eldex, mini-pompe LDC VS, modèles 200 et 300 de SSI, etc.). Aux pressions de 500 psi à 6000 psi (35-420 kg/cm²), il améliore la précision des analyses quantitatives et les limites de détection des constituants des échantillons présents à l'état de traces. Fourni avec raccords et instructions.
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