Résolution des problèmes de contamination des cultures cellulaires
Overview
Types de contamination
Types de contamination
Types de contaminationa href="#commoncauses">Causes communes et prévention des contaminants
Microbien (bactéries, champignons, levures)
Mycoplasma
Contamination virale
Contamination chimique
Conseils et techniques généraux
; Travail dans le cabinet de sécurité biologique
Pipetage et prévention des aérosols
Désinfection<
Désinfection
./a>
Comment effectuer un contrôle de routine des cellules saines
.
Culture Contamination :
Bien que la contamination des cultures cellulaires évoque généralement des bactéries parmi les cellules et des milieux troubles, les envahisseurs indésirables dans les flacons de culture peuvent prendre de nombreuses formes. Les contaminants viraux et chimiques peuvent également avoir des conséquences considérables sur la santé des cultures, et il est essentiel de s'assurer que les lignées cellulaires ne sont pas contaminées de manière croisée pour garantir la reproductibilité des résultats.
Quelle est l'ampleur de la contamination des cellules ? D'après des études menées par la FDA, l'ATCC et d'autres organismes, on estime que 5 à 30 % de toutes les cultures cellulaires sont aujourd'hui contaminées par des espèces de mycoplasmes. L'incidence de la contamination virale des lignées cellulaires courantes a dépassé 25 % dans une étude5, et les virus non cytopathiques sont encore plus susceptibles que les mycoplasmes d'échapper à la détection, car la santé de la culture peut ne pas fournir d'indices de leur présence.
Mycoplasma : justify ; Mycoplasma : justify.
Figure 1.Contamination des cellules
La contamination bactérienne, fongique (y compris les moisissures) et levurienne est généralement visible à l'œil nu sous la forme d'une turbidité et d'un changement de couleur rapides du milieu de culture (à condition que le médium est complété par du rouge de phénol, l'indicateur de pH non toxique le plus courant). L'observation microscopique quotidienne des cultures permet donc de détecter rapidement une contamination microbienne et de prendre les mesures qui s'imposent dès que les premiers signes deviennent apparents. En particulier, l'élimination rapide des cultures contaminées est nécessaire pour protéger les cultures voisines, ainsi que l'environnement stérile de la culture de tissus, y compris les incubateurs de culture, les bains et l'armoire de biosécurité. En outre, des mesures spécifiques la recherche de bactéries et de champignons devrait être utilisée dans le cadre d'une procédure de contrôle de la qualité.
Causes communes et prévention de la contamination microbienne
| Root / Cause | Prévention |
|---|---|
| Technique : | |
| Manipulations, pipetage, distribution | |
| Surfaces et équipements non stériles | Effacer les éléments de la zone de travail qui ne sont pas utilisés immédiatement. |
| Les écoulements sur les goulots et l'extérieur des bouteilles et sur la surface de travail | Tamponnez régulièrement avec de l'alcool à 70 %. Ne pas verser les liquides. Distribuer à l'aide d'une pipette, d'un distributeur automatique ou d'un dispositif de transfert. Si le versement est inévitable : (1) faites-le d'un seul mouvement régulier, (2) jetez le flacon à partir duquel vous versez. |
| Toucher ou tenir la pipette trop près de la pointe, toucher le col des flacons, l'intérieur des bouchons à vis | Tenir les pipettes au-dessus des graduations. Manipuler les pipettes stériles par le manchon de suremballage. |
| Rejeter les déchets dans un bécher | Déverser les déchets dans un bécher à l'aide d'un entonnoir ou, dans la mesure du possible, utiliser le vide pour aspirer les déchets. |
| Poussière sédimentaire ou particules de peau se déposant sur la culture ou la bouteille ; mains ou appareil tenu au-dessus d'une assiette, d'une bouteille ou d'un plat ouvert | Ne jamais passer les mains, travailler au-dessus de récipients ouverts Ne pas travailler au-dessus (flux laminaire vertical et banc ouvert) ou derrière et au-dessus (hotte à flux laminaire horizontal) d'une bouteille ou d'un plat ouvert. |
| Cheveux, mains, haleine, vêtements | |
| Poussière de peau, de cheveux ou de vêtements tombée ou soufflée dans la culture ; | Lavez-vous soigneusement les mains, portez une blouse de laboratoire non pelucheuse. Utilisez une blouse de laboratoire réservée exclusivement à la salle de culture. Attachez les cheveux longs ou portez un bonnet. Faire face au travail lorsqu'il est nécessaire de parler. |
| Aérosols provenant de la parole, de la toux, des éternuements, etc. | Éviter de travailler avec un rhume, ou porter un masque. |
| Matériels et réactifs | |
| Solutions | |
| Réactifs et milieux non stériles | Filtre ou autoclavez les solutions avant de les utiliser. |
| Procédures de stérilisation inadéquates | Surveillez les performances de l'autoclave à l'aide d'un thermomètre enregistreur ou d'un indicateur de stérilité. Testez ou cultivez les solutions stérilisées si vous soupçonnez une contamination. |
| Mauvais contrôle de la qualité chez le fournisseur commercial | Obtain médias, tampons, sérums uniquement auprès de fournisseurs réputés qui certifient la qualité et la source. |
| Verrerie et bouchons à vis | |
| Poussière et spores provenant du stockage | Enveloppez les bouchons avec du papier d'aluminium. Essuyez les bouteilles avec de l'alcool à 70 % avant de les placer dans la hotte. |
| Instruments, pipettes | |
| Stérilité peu fiable | Utilisez des fournitures jetables, stériles et emballées individuellement provenant d'un fournisseur réputé. Stérilisez les articles réutilisables à la chaleur sèche avant de les utiliser. |
| Contact avec une surface non stérile ou un autre matériau | Ne saisissez aucune partie d'un instrument ou d'une pipette qui passera dans un récipient de culture. |
| Flacons de culture et flacons de milieu en cours d'utilisation | |
| Poussière et spores provenant de l'incubateur ou du réfrigérateur ; ; | Utiliser des capsules à vis au lieu de bouchons. Tamponner les flacons avant de les placer dans la hotte. Utilisez une enceinte de confinement secondaire pour les plaques. |
| Conditions d'entreposage ou d'incubation sales | Couvrez les bouchons et les goulots des bouteilles avec du papier d'aluminium pendant l'entreposage ou l'incubation. Nettoyez régulièrement les magasins et les incubateurs. |
| Média sous le bouchon et se répandant à l'extérieur de la bouteille | Mettez au rebut toutes les bouteilles qui présentent des écoulements à l'extérieur du goulot. Ne les versez pas. |
| Équipement et installationsEquipement et installations./span> | |
| Air ambiant | |
| Drafts, tourbillons, turbulences, poussières, aérosols ; | Dédier un espace approprié à la culture de tissus/cellules Réduire le trafic et les activités étrangères. Essuyez régulièrement le sol et les surfaces de travail. |
| Cabinets de biosécurité à flux laminaire | ; |
| Filtre perforé | Vérifiez régulièrement l'absence de trous et de fuites sur les filtres. |
| Filtre encrassé | Vérifier la perte de charge dans le filtre. |
| Écoulements, en particulier dans les fissures ou sous un plan de travail | Désinfectez régulièrement autour et sous le plan de travail. Laissez l'alcool couler dans les fissures. |
| CO2 incubateurs humidifiés | |
| Nettoyer régulièrement selon les spécifications du fabricant avec une désinfection appropriée. | |
| Spores, etc, transportées par circulation d'air forcée | Enfermer les plats ouverts dans des boîtes en plastique avec des couvercles bien ajustés (mais ne pas sceller les couvercles). |
| Bains et autres équipements | |
| Contamination dans les bains d'eau utilisés pour réchauffer les solutions ; ; | Nettoyer et désinfecter les bains-marie régulièrement ; essuyer soigneusement les récipients avec de l'alcool à 70 % avant de les transférer dans une enceinte de biosécurité pour les utiliser une fois secs. |
| Poussière sur les bouteilles de gaz, les pompes, etc. | Envisager l'utilisation d'un bain chauffant sans eau (billes). Essuyer avec de l'alcool à 70 % avant d'entrer dans la salle de culture. |
| Importation de matériels biologiques | ; |
| Lignées cellulaires entrantes | |
| Contamination suspectée à la source ou pendant le transit | Manipulez ces lignées cellulaires seules, de préférence en quarantaine. Vérifiez l'absence de contamination en cultivant une lignée cellulaire pendant deux semaines sans antibiotiques. Vérifier la contamination visuellement, par microscopie à contraste de phase et Hoechst/DAPI pour le mycoplasme. |
Figure 2.Des agents courants de détection de l'ADN, tels que le DAPI ou le Hoechst, révèlent la présence de mycoplasmes dans des cultures contaminées (à droite) à l'aide de la microscopie à fluorescence.
Prévenir, détecter et éliminer la contamination par les mycoplasmes
Une fois que les mycoplasmes contaminent une culture, ils peuvent rapidement se propager à d'autres zones du laboratoire. Le respect strict des bonnes pratiques de laboratoire est essentiel, et les tests de routine pour les mycoplasmes sont fortement recommandés pour un contrôle réussi de la contamination par les mycoplasmes. Les trois méthodes de détection les plus courantes comprennent culture de mycoplasme, Méthode de coloration de l'ADN et détection basée sur la PCR.Nous offrons une variété de solutions pour détection et élimination des mycoplasmes. Il est essentiel de mettre en place une routine de dépistage des mycoplasmes dans les cultures, même si vous ne soupçonnez pas la présence de ce contaminant dans le laboratoire.
Prévenir la contamination microbienne: ; les antibiotiques sont-ils la solution ? L'un des aspects de la culture de tissus est l'utilisation systématique d'antibiotiques, soit seuls, soit en cocktails avec des antifongiques. Tout comme pour les antibiotiques thérapeutiques prescrits par les médecins, l'utilisation continue ou inappropriée d'antibiotiques peut entraîner le développement de souches résistantes difficiles à éradiquer et peut nécessiter l'utilisation d'antibiotiques de génération ultérieure qui peuvent être toxiques pour les cultures cellulaires. Des études récentes ont soulevé d'autres préoccupations concernant le potentiel d'altération de l'expression des gènes dans les cellules cultivées en présence d'antibiotiques. |
Contamination virale
Les virus sont parmi les contaminants les plus difficiles à détecter dans les cultures cellulaires.Les virus sont parmi les contaminants de culture cellulaire les plus difficiles à détecter en culture, car ils nécessitent des méthodes de microscopie qui ne seraient pas pratiques pour la plupart des laboratoires de recherche. Ils peuvent provenir de la source cellulaire du patient ou de l'animal hôte, et il a été démontré que plusieurs lignées cellulaires importantes sur le plan biotechnologique contenaient des rétrovirus endogènes. Le plus souvent, les cellules sont infectées par des virus présents dans les matériaux d'origine animale utilisés pour les cultiver. La petite taille des virus les rend très difficiles à éliminer des milieux, des sérums et d'autres solutions d'origine biologique. Cependant, comme la plupart des virus sont limités à l'hôte et même au tissu, cela peut limiter leur capacité d'infection inter-espèces ou inter-tissus. Bien que les virus soient plus fréquents dans les cultures cellulaires que ne le pensent de nombreux chercheurs, ils peuvent ou non constituer un facteur de confusion important pour la culture cellulaire s'ils n'induisent pas d'effets cytopathiques ou d'autres effets néfastes sur les cellules. Des précautions de sécurité particulières doivent toujours être prises lorsque l'on travaille avec des tissus ou des cellules provenant d'êtres humains ou d'autres primates, afin d'éviter la transmission éventuelle d'une infection virale (VIH, hépatite B, Epstein-Barr, virus de l'herpès simien B, entre autres) des cultures cellulaires au personnel de laboratoire. Les responsables institutionnels de la sécurité environnementale doivent être consultés au sujet des procédures à suivre pour travailler avec des tissus, des cultures ou des virus potentiellement dangereux. Pour en savoir plus sur l'évaluation des risques pour le personnel de laboratoire travaillant avec des cultures cellulaires, cliquez ici
Bonnes pratiques pour réduire l'incidence de la contamination virale des cultures cellulaires:
*Limiter le nombre de sources biologiques (fournisseurs, animaux) à partir desquelles les cellules sont extraites.
*Sélectionner des animaux/cellules qui sont moins sensibles aux virus.
*S'approvisionner en cellules auprès de dépôts qui effectuent des tests sur les virus et fournissent une certification de lignées cellulaires exemptes de virus.
Contamination chimique
Tout contaminant non vivant de la culture cellulaire est souvent classé comme un contaminant "chimique".Ces contaminants peuvent provenir des réactifs ou de l'eau utilisés dans les milieux ou les tampons, ou encore du matériel et des fournitures. Les exemples incluent les radicaux libres, les ions métalliques, les résidus de désinfectants/détergents, voire les endotoxines qui persistent après que les contaminants bactériens en amont ont disparu.
Conseils pour prévenir la contamination chimique :
*Utilisez toujours de l'eau de qualité laboratoire pour préparer les tampons et les solutions, et remettre en suspension les réactifs lyophilisés.
*Toute la vaisselle réutilisable doit être rincée à fond et séchée à l'air - l'autoclavage n'a aucun effet sur les résidus de détergent.
*Obtenir des milieux, des suppléments et du sérum (FBS, FCS) exclusivement auprès de fournisseurs certifiés pour les tests d'endotoxines.
Conseils et techniques généraux pour prévenir et éliminer la contamination<
Travail dans un poste de sécurité biologique
Au moins vingt minutes doivent s'écouler après le démarrage du flux d'air avant de placer les articles à utiliser dans l'armoire. Tous les articles qui entrent dans l'enceinte doivent d'abord être vaporisés d'alcool stérile à 70 % (v/v) et essuyés avec des lingettes non pelucheuses afin d'empêcher la poussière et les particules de pénétrer dans l'enceinte. Veillez à ce que le flux d'air soit bien établi avant d'ouvrir les couvercles ou les conteneurs, afin de permettre au flux d'air de purger la zone de travail des particules qui pourraient y avoir été introduites.
La méthode d'échantillonnage de la substance est la suivante
Figure 3.Travailler dans une armoire de sécurité
Pipettes et prévention des aérosols
Les pipettes en plastique jetables - également appelées "aérosols" - sont utilisées dans les laboratoires.Les pipettes en plastique jetables - également appelées pipettes sérologiques, disponibles dans des capacités de 1 à 100 ml - sont des outils indispensables pour la culture cellulaire. Elles doivent être emballées individuellement pour garantir leur stérilité. Le respect des conseils suivants peut minimiser les risques de contamination et de sécurité associés au pipetage.
- Utiliser des aides à la pipette automatiques, chaque aide à la pipette ne pouvant être utilisée que dans une seule armoire. Pour éviter la contamination, démonter et désinfecter régulièrement les pièces de l'aide à la pipette. Veillez à ce que les filtres des aides à la pipette soient bien stockés et changés régulièrement.
- Utilisez des pipettes bouchées (bouchées en haut avec du coton) chaque fois que possible, en particulier lors du transfert de milieu. Évitez d'aspirer du liquide dans le bouchon de la pipette. Si le bouchon est accidentellement mouillé, changer immédiatement le filtre de l'aide à la pipette.
- Éviter de toucher la pipette sérologique en la déballant partiellement, en ajustant l'extrémité à l'aide à la pipette, puis en retirant le manchon de papier.
- Pour éviter de générer des aérosols contaminants, ne pas créer de bulles dans le milieu ou dans la pipette.
Désinfection
Les méthodes conçues pour la désinfection/décontamination des déchets de culture, des surfaces de travail et de l'équipement doivent non seulement minimiser le risque de contamination, mais aussi être sûres pour le personnel du laboratoire. Portez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, tel que des gants et une protection oculaire, lorsque vous utilisez des formes concentrées de désinfectants. Les gants choisis doivent protéger contre la substance manipulée. Les tableaux des fabricants permettent d'identifier les gants les mieux adaptés à une tâche donnée. Les principaux désinfectants sont classés par groupes et leurs mérites relatifs peuvent être résumés comme suit :
Hypochlorite de sodium ou eau de Javel
- Bon désinfectant d'usage général
- Actif contre les virus
- Corrosif contre les métaux - ne doit pas être utilisé sur des surfaces métalliques telles que les centrifugeuses
- Désinfectant d'usage général
- Corrosif contre les métaux - ne doit pas être utilisé sur des surfaces métalliques telles que les centrifugeuses.
- Facilement inactivé par les matières organiques et doit donc être renouvelé fréquemment
- Utiliser de l'eau de Javel commerciale pour créer une solution à 10% (v/v) dans les déchets liquides ou pour la désinfection des surfaces
Alcool (par ex.g. Ethanol, Isopropanol)
- Concentrations efficaces : 70% pour l'éthanol, 60-70% pour l'isopropanol
- Efficace contre les bactéries. L'éthanol est efficace contre la plupart des virus, mais pas contre les virus non enveloppés
- L'isopropanol n'est pas efficace contre les virus
- Les aldéhydes sont des irritants, et leur utilisation doit être limitée
Les désinfectants à base de phénols doivent être évités, car ils ne sont pas pris en charge dans le cadre du programme d'examen de la directive de l'UE sur les produits biocides.
Comment effectuer le contrôle de routine des cellules saines
Le contrôle des cultures cellulaires est une partie importante de la culture cellulaire quotidienne. Ce tutoriel vous aidera à expliquer les bases du contrôle de vos cellules, y compris l'aspect d'une culture saine, la confluence des cellules et les différentes phases de croissance d'une culture cellulaire. Cette vidéo présente également les indicateurs courants de la contamination par les bactéries et les mycoplasmes.
Produits apparentés
Références
Pour continuer à lire, veuillez vous connecter à votre compte ou en créer un.
Vous n'avez pas de compte ?Pour le confort de nos clients, cette page a fait l’objet d’une traduction automatique. Nous nous sommes efforcés de garantir l’exactitude de cette traduction automatique. Toutefois, la traduction automatique n’est pas parfaite. Si vous n’êtes pas satisfait du résultat de la traduction automatique, veuillez vous référer à la version anglaise.