小分子HPLC

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小分子分析

小分子特指低分子量化合物(通常小于900道尔顿)。常见小分子包括氨基酸、脂质、糖类、脂肪酸、生物碱等。

现有多种方法可供分离小分子,包括 高效液相色谱(HPLC)液相(LC)气相(GC)薄层色谱(TLC) 和毛细管电泳(CE)。此外,还可通过磁共振波谱法(NMR)或 质谱法(MS)等方法鉴定小分子。最近几年液相色谱-质谱联用分析(LC-MS)成为重要的小分子鉴定技术。

能否确保高效液相色谱HPLC、UHPLC或LC-MS获得理想的小分子分析结果,取决于是否选择了最适宜的固定相和流动相条件。分析物化学特性是决定最适宜的柱化学试剂选择的关键。而速度、样品基质和化合物含量等其他因素决定了最适宜的固定相基质材料。

小分子HPLC分析

小分子HPLC分析通常采用反相分离方式。极性化合物分离可选用亲水作用色谱(HILIC)和正相色谱,前者效果更佳。离子化合物分离可选用离子交换分离方式,有机阴离子或阳离子还可选用离子色谱法。

HPLC色谱柱可填充全孔二氧化硅颗粒、表面多孔颗粒、聚合物颗粒或以整体型硅棒作为固定相,也可使用氧化铝、氧化锆颗粒和碳颗粒。分离小分子时,固定相材料的典型孔径范围为60Å-160Å。HPLC固定相粒径通常为3µm至5µm范围,UHPLC粒径通常为2µm或更小。固定相可连接不同的柱选择性修饰。C18烷基链是反相(RP)色谱法中最常用的柱化学修饰。但其他修饰——如C30、C8、苯基、五氟苯基和广泛的极性更强的修饰以及具有离子交换或手性的修饰——几乎可以分离所有溶于液体的化合物。RP-HPLC的流动相通常含有水相缓冲液或水和水溶性有机溶剂,如乙腈或甲醇。


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HPLC样品制备

复杂及基质丰富的样品,如食品、饮料、化妆品、生物样品和基质丰富型药物制剂(如乳膏剂、糖浆剂)需要有效的样品制备方法来除去无关组分并选择性提取目标分析物。这一点对于粒径极小的固定相尤其重要,如粒径为2µm或以下的UHPLC。常用的样品制备方法有液-液提取、固相提取(SPE);对于生物样品,除过滤处理外,还需进行蛋白沉淀。除选择性洗脱目标化合物和预浓缩外,样品制备的主要目标是保护HPLC固定相不会因样品基质造成堵塞。硅胶整体化HPLC色谱柱可容纳大量基质,样品制备工作远少于颗粒型色谱柱。

衍生化

某些小分子需要在HPLC分离前(柱前)后(柱后)进行衍生化。衍生化步骤可将分子转化为其衍生物,从而提高HPLC灵敏度或色谱保留性。须根据所需的衍生化反应选用具有所需物理和化学性质的化学试剂。






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