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细胞生长和维持

使用BrdU染色增殖E4鸡胚眼中的细胞

细胞培养是在生命科学研究中建立相关生物学模型或产生重组蛋白、病毒颗粒或生物疗法的一项基本技术。细菌、酵母和哺乳动物细胞等培养细胞的生长和维持是在生物安全柜(也常称为细胞或组织培养罩)中进行的,并使用了适当的无菌技术以防止微生物和化学品的污染。

细胞培养的类型

最突出的两种哺乳动物细胞培养方法是原代培养和连续培养。其中,原代培养物直接来源于人体或动物组织,其寿命受细胞衰老限制。连续培养物则在培养中被视为是“永生化”的,因为其通常来源于患者的癌症组织。细胞系也可通过永生化细胞来创建,并且可在多个或无限的细胞分裂周期下被连续培养或传代


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培养中细胞的维持和增殖

细胞可以悬浮培养,或作为附着在组织培养瓶或多孔板上的2D单层进行培养。培养方法由细胞的“组织来源”决定;来源于血液的细胞一般采用悬浮培养,而来自于实体组织的细胞则通常进行单层生长。

一般认为3D细胞培养模型(类器官和球状体)比在2D表面上生长的细胞更能模仿细胞的体内环境。球状体通常是由癌细胞系或肿瘤活检组织(来自患者的异种移植物或PDX)在超低附着平板中形成的自由漂浮细胞聚集体,而类器官则通常来自包埋的组织干细胞,并随后在ECM水凝胶中发生分化。

细胞生长阶段

确保充分的细胞生长对于从细胞培养研究中收集准确的数据至关重要。可使用血球计数仪或能够更加精确进行细胞计数的自动化细胞计数仪进行细胞计数。

培养中的细胞生长通常会经历四个阶段:

  1. 滞后阶段 - 细胞在调整适应培养条件,并不会发生分裂。
  2. 对数生长阶段 - 细胞在活跃地进行分裂,因此这是评估种群生长或收集数据的最佳阶段。对数阶段后期是传代(继代培养)细胞的最佳时机。
  3. 平台(静态)阶段- 生长随着细胞接近100%的汇合度而放缓,此时细胞也会随着细胞废物的累积和资源耗尽而最易发生应激或损伤。
  4. 下降阶段 - 活细胞种群随着细胞死亡占据主导而发生下降。

细胞培养基、添加剂和试剂

培养的细胞需要补充用于生长的营养素。除了提供平衡的盐、碳水化合物、氨基酸、维生素、脂肪酸和脂质、蛋白质和肽、微量元素和生长因子外,哺乳动物细胞培养基还必须保持生理性pH值。胎牛血清(FBS)是哺乳动物细胞培养中使用最广泛的生长补剂,因为其含有多种上述的必需细胞营养素,并已被证明可支持培养中细胞和组织的生长。对于需要明确培养基或减低动物成分的应用,无异种培养基制剂可提供具有已知组成的无动物成分制剂。

由于培养基和补剂通常也为机会性微生物的生长提供了丰富的营养,因此成功的细胞培养需要无菌技术和定期观察,以确保不存在会导致细胞死亡或混淆体内样生长的污染物。对于无法在通过显微观察到的常见微生物污染物,可使用支原体检测试剂进行定期筛查以保护培养物和组织培养环境。

酵母培养物,如酿酒酵母巴斯德毕赤酵母(毕赤酵母),常用于重组蛋白表达和基因功能研究。酵母培养基制剂中通常包含的重要营养素包括蛋白胨、酵母提取物和右旋糖或葡萄糖。

细胞传代培养建议与技巧

细胞传代是常规细胞培养中维持细胞健康和最佳细胞生长的一个基本步骤。本教程解释细胞传代的过程,包括融合度和细胞密度的重要性。细胞传代的实验方案包括监测和计数细胞、细胞的胰蛋白酶化或解离以及将细胞重新铺板到新培养皿中等过程。

细胞培养环境和培养器具

培养的细胞使用一次性无菌塑料器具进行生长和处理,包括组织培养瓶和多孔板、血清移液管、无菌瓶顶滤器和无菌注射器滤器。塑料组织培养瓶和平板通常都是处理过的,具备亲水表面,以促进贴壁细胞的附着。 作为2D表面的替代品,基于微孔膜的平板可为复杂细胞测定,如细胞迁移、细胞间通讯和细胞极化,提供更具生理性的生长环境。

培养的细胞必须被维持在可重现其来源物种中这些参数的温度和气体环境中。含有细胞和培养基的培养皿通常会被保存在可精确控制温度和气体混合物的培养箱中。但是,采用微流体技术并有利于对不间断培养中的细胞进行成像的小型台式培养系统,可为预测性体外模型提供最真实的环境。




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