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核酸标记和检测

DNA和RNA标记和检测方法以及具体实验步骤

核酸、PCR产物和寡核苷酸的检测和标记方法多种多样。其常见标记和检测试剂及方法主要取决于被标记分子的类型及其下游应用等多种因素。因此,酶催化和化学方法都可用来标记核酸,并结合荧光分子、酶及放射性元素等多种分子。

核酸标记与探针

可在整个分子上或在 5’ 和 3’ 末端对核酸进行标记。核酸探针特别可用于核酸杂交测定,比如,北方墨点中的RNA检测或南方墨点中的DNA检测。各种方法用于在整个探针上分配标记,包括使用标记的脱氧核苷酸(dNTP) 或核苷三磷酸(NTP)的 PCR 技术,随机引物和缺口平移。末端标记特别可用于测定和研究核酸-蛋白相互作用,以避免空间位阻。

核酸标记和检测试剂盒

根据不同的标记方法,酶标记探针通常使用比色检测法,而放射性探针则多采用放射自显影检测法。另外,地高辛(DIG)和荧光基团等标记的常用探针还可组合使用,与比色反应(比如碱性磷酸酶)相结合进行多色探针检测。利用大量DNA聚合酶将生物素修饰过的尿嘧啶(Biotin-16-dUTP)在聚合酶链式反应中合成到核酸中也可作为一种标记和检测方法。荧光原位杂交利用荧光探针来检测DNA序列,其检测和下游分析的成败部分取决于研究人员所使用的荧光显微镜的灵敏度和分辨率。

标记DNA和RNA的应用

首先可用于印迹法中。印迹法指将生物大分子转移到固态膜上的方法。另外,由于标记探针具有特异性,所以研究人员可以利用核酸及标记探针的分子杂交在复杂核酸混合物中检测DNA和RNA序列。而且,上述标记方法还有助于获得分析基因表达、信使RNA的大小和拷贝数等有用信息。研究人员还常用原位杂交技术来检测一个或者多个不同的标记探针(如DIG和荧光基团标记的探针)。


相关技术文章

相关实验方案

  • 存在有多种可与BM Purple(或通常的NBT/BCIP)组合的复染剂,包括FastGreen FCF和Nuclear Fast Red。
  • 使用最邻近法或基础法等理论方法对寡核苷酸的解链温度(Tm)进行计算。DNA Tm是指50%寡核苷酸与其完美互补链构成双链体,而另外50%游离于溶液中的温度。
  • Northern和Southern印迹简介:两种将大分子转移到膜支持物的常用方法。该文章还提供了Northern印迹和Southern印迹的实验方案。
  • 硫酸葡聚糖以钠盐形式供应,使其在水中可溶且稳定。硫酸葡聚糖含有大约17%的硫,相当于每个葡糖基残基大约有2.3个硫酸基团。
  • 为了特异性地检测固定在固体支持物上的抗原或靶分子,必须将支持物上未被占据的结合位点进行封闭以防止探针和检测分子结合。
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