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qPCR

基于SYBR Green 的 qPCR

实时定量PCR(qPCR)利用荧光报告分子对被扩增的产物进行定量分析。与传统PCR方法相同,qPCR会对某个DNA、cDNA或者RNA模版链进行扩增,但不同的是,在每一个循环中,都会监测荧光信号以进行相对或绝对的定量分析。在基因表达分析、基因型分型、微RNA分析、遗传变异分析以及蛋白分析等领域都发挥着重要作用。  

如何分析 qPCR 数据

一般通过插入双链DNA碱基中的染色剂(如SYBR ® GREEN、溴化乙錠)或能结合到DNA特定序列上的探针(如分子灯塔、TaqMan®探针)对报告分子的荧光强度进行检测并定量。

qPCR 数据的相对量化

定量分析qPCR数据主要有两种方法。第一种是最常用的相对定量分析,通过分析ΔΔCt的信息,可比较目标基因与参考基因并利用参考基因的表达比例进行归一处理,从而确定目标基因的表达量或丰度。鉴于目标基因和参考基因的效率E值不同,该方法还可分析E值的差异。在基因表达分析中该方法更为常用。

qPCR 数据的绝对量化

第二种是绝对定量分析,利用标准曲线(SC)法进行定量分析,常用于环境微生物学。SC法是对已知浓度的模版N0进行梯度稀释,从而建立log(N0)对CT(循环阈值)的线性回归标准曲线,然后可用于计算样品中模版的浓度。使用该方法,一定要保证样品和标准曲线中的效率值相同。 


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