凝胶电泳

蛋白凝胶电泳。利用凝胶电泳槽进行蛋白凝胶电泳

蛋白质凝胶电泳是一种常用蛋白质分离技术,适用于蛋白质纯化、鉴定和检测应用。此方法要求带电蛋白分子在电场作用下在凝胶上迁移,迁移速率则取决于蛋白质的大小、形状和所带电荷量。

聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶均可作为蛋白质电泳的基质。此类基质可充当分子筛,蛋白质越小,迁移速度越快。琼脂糖凝胶孔径偏大,可分离半径超过5-10 nm的蛋白质,如分子量较大的蛋白质复合物。聚丙烯酰胺凝胶孔径偏小,可分离5 kDa至2000 kDa的蛋白质,在蛋白质电泳中最为常用。

现有多种蛋白质凝胶电泳方法,各自提供不同的目标蛋白信息。


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SDS-PAGE

十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可根据分子量大小分离蛋白质。此方法要求在电泳缓冲液中加入SDS去垢剂。SDS会使蛋白质带上净负电荷,从而掩盖其固有电荷。随着蛋白质在含SDS和变性剂的条件下分离,迁移形状也从球形逐渐变为线形。因此,SDS结合蛋白在凝胶中的迁移速率主要取决于蛋白质大小,与蛋白标准品对比即可估算其分子量。

Native PAGE

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)可在分离蛋白质的同时保留其天然构象(三级结构)、亚基相互作用(四级结构和蛋白互作)和生物活性。此方法要求蛋白质的制备和电泳均在非还原、非变性的条件下进行。由于每种蛋白质可能因自身所带电荷朝不同电极迁移,且迁移速率取决于自身形状和结合形式,故蛋白质迁移迁移状况由复杂的综合因素决定。因此,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳不宜用于测定分子量。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳通常适用于需要纯化活性蛋白或需要检测只识别天然形式蛋白的抗体的应用。

等电聚焦电泳(IEF)

等电聚焦电泳利用电场和pH梯度按蛋白等电点(pI)分离蛋白。蛋白在pH梯度中移动时,净电荷发生改变。每种蛋白在电场作用下都迁移到其净电荷变为0的pH位点(即蛋白的等电点)上。因此分离过程中,样品中蛋白积聚或“聚焦”在特定和可预测的凝胶位点。等电聚焦用于复杂样品(如细胞和组织裂解物、血浆)的蛋白鉴定、翻译后修饰分析以及质谱分析样品的分离。

二维凝胶电泳

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D PAGE)依照等电点(pI)和分子量分离蛋白。等电聚焦电泳(IEF)根据等电点分离蛋白,SDS-PAGE根据分子量分离蛋白。二维凝胶电泳提供分辨率最高的蛋白分析,可在一片凝胶上同时分离成百上千种蛋白,常用于蛋白组学研究。




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