蛋白质Pull-Down

亲和Pull-Down检测

Pull-down检测法可用于确定两种或多种蛋白质之间相互作用。在亲和pull-down检测中,“诱饵”蛋白被标记,并通过共价连接或亲和标记(例如,固定化金属亲和色谱法(IMAC))捕获在固定的配体(支持珠)上。常见的诱饵蛋白融合标记包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和组氨酸标记蛋白。诱饵蛋白首先形成复合物,然后与蛋白源(如细胞或组织裂解物)一起进行孵育。随后,通过一系列洗涤步骤将目标蛋白质从珠子载体上洗脱下来,并离心收集。与免疫沉淀(IP)和Co-IP分析方法不同,亲和pull-down法的纯化和检测并不依赖抗原与抗体的相互作用。对于所有pull-down检测来说,通常通过SDS-PAGE、质谱分析和蛋白免疫印迹检测分析纯化的样品,以进行进一步的下游分析。

亲和GST Pull-Down应用

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是在大多数生物体中存在的一种211氨基酸蛋白质。GST通常被整合到表达载体中,以便在大肠杆菌蛋白表达系统中生产融合标签。GST标签是一种大分子蛋白标签(约26 kDa),可以在细菌、酵母、哺乳动物和昆虫细胞中表达。如果需要避免细胞内蛋白酶裂解重组蛋白,或需要增强标记蛋白溶解性时,GST标签是更佳的选择。此外,GST蛋白是一种高亲和力标签,可轻松纯化,并可利用经济型亲和树脂在温和洗脱条件下进行pull-down实验。

免疫共沉淀

Pull-down检测是验证免疫共沉淀结果的理想方法,也是鉴定未知蛋白与蛋白相互作用以及特定蛋白活化状态的绝佳方法。与亲和pull-dwon方法不同,IP利用抗体结合并分离复杂的生物样品中的抗原。

Co-IP指利用抗体结合多蛋白复合物中的抗原。随后添加蛋白质A或蛋白质G培养基,捕获此复合物。蛋白A/G对多克隆和单克隆IgG型抗体Fc区具有高度亲和力,因而成为纯化目标蛋白或蛋白质复合物的关键组分。蛋白pull-down法是研究蛋白-蛋白相互作用网络的重要工具,但具体方法选择取决于研究人员的具体应用需求。


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