用胰蛋白酶解离细胞

有多种蛋白水解酶可用于从粘附底物上脱离细胞，其中最常使用的是丝氨酸蛋白酶家族成员胰蛋白酶。 胰蛋白酶由胰腺外分泌细胞分泌的酶原—胰蛋白酶原产生，作用于赖氨酸或精氨酸的C末端侧。其活性最适温度为37℃，因此预热胰蛋白酶可加速脱离。用高胰蛋白酶浓度长时间孵育，会剥离细胞表面蛋白并杀死细胞。

胰蛋白酶为许多细胞类型所耐受；然而，在蛋白质组学研究和无血清培养中需要避开胰蛋白酶。根据应用和细胞类型，可采用不同成分和浓度的胰蛋白酶。其部分性质如下。

• EDTA（乙二胺四乙酸二钠）： 在存在钙的情况下，粘附分子决定细胞-细胞以及细胞-基质间的相互作用。为了减弱这种相互作用，经常会在胰蛋白酶中添加EDTA，其螯合二价阳离子（Ca²⁺，Mg²⁺）。
• 酚红：胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH范围内实现（5466615）。在此范围内的酚红呈粉红色。由于环境条件，胰蛋白酶的pH可能变为酸性，呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。通过用NaOH调节pH至7.4-7.6可以优化胰蛋白酶活性。
• 稀释剂：将浓缩的胰蛋白酶溶解或稀释在不含Ca²⁺或Mg²⁺的缓冲盐溶液中，例如Hank平衡盐溶液（产品编号：H9394），以维持pH和渗透平衡。此外，一些胰蛋白酶产品含有0.9％ NaCL作为稀释剂，而不是Hank平衡盐溶液。
• 来源和形式：胰蛋白酶的主要来源是猪，其以冻干粉末形式或溶液形式提供。为了避免动物或微生物产品，重组牛胰蛋白酶也在玉米中表达，称为Trypzean溶液（T3449）。
• 浓度：根据细胞类型和应用，胰蛋白酶以不同浓度使用。对于强附着细胞系，使用2.5％至0.25％（1X至10X倍稀释）的胰蛋白酶。尽管有需要细胞表面蛋白质完整性的研究，但一般采用较低浓度（0.05％胰蛋白酶）溶液。

实验方案

• 将胰蛋白酶溶液、平衡盐溶液（不含Ca⁺²和Mg⁺²的溶液）以及生长培养基预热至37 ^°C。
  
• 检查细胞以确保细胞健康且无污染。
  
• 从培养瓶中取出并丢弃培养基
  
• 用不含Ca⁺²和Mg⁺²离子的平衡盐溶液轻轻冲洗细胞，然后除去溶液。也可以用胰蛋白酶溶液洗涤牢固贴壁的细胞。然而，对于敏感细胞，首选平衡盐溶液。
  
• 将适量（0.5 mL/10cm²）预热后的胰蛋白酶溶液添加至培养瓶侧壁。轻轻旋转内容物以覆盖细胞层。
  
• 将容器在室温下孵育2-3分钟。牢固贴壁的细胞可以在37 ^°C快速脱离。在显微镜下观察细胞。脱离的细胞在显微镜下呈现圆形且有折射光。如果脱离的细胞少于90％，则将培养瓶再孵育2分钟，并每隔30秒在显微镜下观察一次细胞。
  注意：防止细胞暴露于胰蛋白酶溶液时间过长（> = 10分钟）。
  
• 细胞脱落后，加入2倍体积预热的完全生长培养基以灭活胰蛋白酶。向细胞层表面轻轻移液培养基数次，以确保细胞回收率 > 95％。对于无血清培养物，以等摩尔浓度添加黄豆胰蛋白酶抑制剂（产品编号：T6414）以抑制胰蛋白酶。
  注意：剧烈移液会导致细胞损伤。
  
• 将细胞悬液转移至试管中，并以300-1000×g轻轻离心5-10分钟。除去上清液，将细胞沉淀团轻轻重悬于预热的完全生长培养基中。用血细胞计数器和台盼蓝排除法或自动细胞计数器，去除所需样品以确定活细胞的细胞密度。
  
• 将剩余溶液稀释至接种密度，并将适量体积吸移至培养瓶中，然后将其置于培养箱中。

故障排除：细胞解离