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主页哺乳动物细胞培养利用胰蛋白酶的细胞解离实验方案

胰蛋白酶细胞解离方案

胰蛋白酶用于细胞培养

细胞解离是细胞传代过程中的一个步骤,即细胞从预处理表面分离,形成悬浮液。这些悬浮液对于传代培养重新接种、细胞计数分析和细胞增殖非常重要。有多种蛋白水解酶可用来从粘附基质上脱离细胞,胰蛋白酶就是其中之一。

胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶家族成员,常用于脱离细胞。胰蛋白酶的最佳活性温度为 37 °C,因此时常采用预热胰蛋白酶的方法加速细胞脱离。然而,长期在高胰蛋白酶浓度下孵育可能会剥离细胞表面蛋白并杀死细胞,从而损害细胞。 

 

细胞解离产品

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胰蛋白酶性质

许多细胞类型都耐受胰蛋白酶。但对于需要无血清培养的蛋白质组学研究和实验,通常要避免使用胰蛋白酶。根据应用和细胞类型,可以采用不同成分和浓度的胰蛋白酶。其部分性质如下。

  • EDTA(乙二胺四乙酸二钠):在存在钙的情况下,粘附分子决定细胞-细胞以及细胞-基质间的相互作用。经常会在胰蛋白酶中添加EDTA,以与二价阳离子(Ca2+、Mg2+)螯合并削弱这些相互作用。
  • 酚红:pH 7-9范围内,胰蛋白酶具有最佳活性。\在此范围内,酚红内含物使溶液呈粉红色。由于环境条件,胰蛋白酶的pH可能变为酸性,呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。用NaOH调节pH至7.4-7.6,可恢复胰蛋白酶活性。
  • 稀释液:为了帮助维持pH值和渗透压平衡,浓缩胰蛋白酶可以用不含 Ca2+ 或 Mg2+ 的缓冲盐溶液(例如 Hank 平衡盐溶液)稀释或溶解。部分胰蛋白酶产品还可用0.9% NaCl稀释。
  • 来源和形式:胰蛋白酶的主要来源是猪,以冻干粉末或溶液形式提供。如需避免动物或微生物来源产品,重组牛胰蛋白酶也可由玉米表达制得(Trypzean 溶液)。
  • 浓度:根据细胞类型和应用,胰蛋白酶以不同浓度使用。对于强附着细胞系,使用2.5%至0.25%(1X至10X倍稀释)的胰蛋白酶。低浓度的胰蛋白酶(例如 0.05%)可用于需要保持细胞表面蛋白完整性的研究。

胰蛋白酶酶解方案

此方案在保持无菌环境(例如在层流生物监测罩中)的条件下进行。

  1. 将胰蛋白酶溶液、平衡盐溶液(不含Ca+2和Mg+2的溶液)以及生长培养基预热至37 °C。
  2. 检查细胞以确保细胞健康且无污染。
  3. 从培养瓶中取出并丢弃培养基
  4. 用不含Ca+2和Mg+2离子的平衡盐溶液轻轻冲洗细胞,然后除去溶液。也可以用胰蛋白酶溶液洗涤牢固贴壁的细胞。然而,对于敏感细胞,首选平衡盐溶液。
  5. 将适量(0.5 mL/10 cm2)预热后的胰蛋白酶溶液添加至培养瓶侧壁。轻轻旋转内容物以覆盖细胞层。
  6. 将容器在室温下孵育2-3分钟。(孵育时间根据所选用的细胞系而异)。牢固贴壁的细胞可以在37 °C快速脱离。在显微镜下观察细胞。脱离的细胞在显微镜下呈现圆形且有折射光。如果脱离的细胞少于90%,则将培养瓶再孵育2分钟,并每隔30秒在显微镜下观察一次细胞。
    注意:防止细胞暴露于胰蛋白酶溶液时间过长(> = 10分钟)。
  7. 细胞脱落后,加入2倍体积预热的完全生长培养基以灭活胰蛋白酶。向细胞层表面轻轻移液培养基数次,以确保细胞回收率 > 95%。对于无血清培养物,以等摩尔浓度添加黄豆胰蛋白酶抑制剂以抑制胰蛋白酶。
    注意:剧烈移液会导致细胞损伤。
  8. 将细胞悬液转移至试管中,并以100-300g轻轻离心5-10分钟。除去上清液,将细胞沉淀团轻轻重悬于预热的完全生长培养基中。用血细胞计数器和台盼蓝排除法或自动细胞计数器,去除所需样品以确定活细胞的细胞密度。  
  9. 将剩余溶液稀释至接种密度,并将适量体积吸移至培养瓶中,然后将其置于培养箱中。
相关材料
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参考文献

1.
Sipos T, Merkel JR. 1970. Effect of calcium ions on the activity, heat stability, and structure of trypsin. Biochemistry. 9(14):2766-2775. https://doi.org/10.1021/bi00816a003
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