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使用无血清和无异源细胞培养基将人外周血单个核细胞(PBMC)体外分化为M1或M2巨噬细胞

巨噬细胞是外周血单个核细胞分化于组织中的专职吞噬细胞和抗原呈递细胞(APC)。在固有免疫和适应性免疫中执行重要的活化和调节功能。1激活的巨噬细胞通常可分为两种表型,M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。经典激活的M1型巨噬细胞(classically activated macrophage, CAM)可作为免疫效应细胞,发挥急性促炎作用。具有强抗菌作用,可产生大量的淋巴因子。2替代激活的M2型巨噬细胞(alternatively activatedmacrophage, AAM)则具有抗炎作用,至少可分为3种亚型。这些亚型各自执行不同的功能,包括免疫调节、耐受维持和组织修复/创伤愈合。1,2实际上,巨噬细胞在面对各种内源和外源刺激时具有高度的可塑性,初始的M1/M2极化过程可以进行转化2,例如,在特定条件下,M2极化的巨噬细胞可转化为M1激活状态。

从组织材料中获取的人原代巨噬细胞数量偏少,并且无法体外扩增。此外,普遍认为组织来源的巨噬细胞通常呈现明显的表型异质性。有鉴于此,改为获取单核源性巨噬细胞(Monocyte-derived macrophage)是不错的选择,首先可大量获取人血单个核细胞(PBMC),接着通过体外分化获得巨噬细胞。PromoCell巨噬细胞生成培养基专用于将PBMC直接高效分化为高纯度的M1或M2型巨噬细胞。PromoCell巨噬细胞生成培养基DXF成分确定、不含血清和异源物质,可创造不含任何动物源刺激的受控培养环境,尤为适合单核细胞和巨噬细胞这类易于激活的免疫细胞。这款培养基有别于FBS,不含有不确定的潜在有害成分,可实现标准化和受控的巨噬细胞分化。用于单核细胞体外分化时,PromoCell M1-巨噬细胞生成培养基DXF(C-28055,含有GM-CSF)可生成CD68+/ CD80+/CD163-M1样极化巨噬细胞,M2-巨噬细胞生成培养基DXF(C-28056,含有M-CSF)可生成CD68+/CD80-/CD163+M2样极化巨噬细胞。巨噬细胞基础培养基DXF(C-28057)不含细胞因子,由用户自行选择适合的补充剂。用户可根据需要选择性地激活和极化特定亚型的M1/M2极化巨噬细胞。

PromoCell M1/M2巨噬细胞生成培养基DXF培养方案概览。

图 1.PromoCell M1/M2巨噬细胞生成培养基DXF培养方案概览。

巨噬细胞分化培养方案

  1. 单个核细胞分离(第0天)。按照实验室日常方案分离血沉棕黄层(buffy coat)中的PBMC。
  2. 单个核细胞分析(第0天)。计数和分析分离的PBMC,确定单核细胞含量(例如,可利用流式细胞仪的FSC/SSC图)。接着用单核细胞贴壁培养基(C-28051)重悬细胞至100X10PBMCs/ml。
  3. 单核细胞贴壁(第0天)。将新鲜分离的PBMC接种在适量的单核细胞贴壁培养基(C-28051)中,例如15 ml培养基/T-75培养瓶。PBMC接种密度为1 million/cm2(单核细胞含量≥25%)和1.5 million/cm2(单核细胞含量<25%)。无需其他操作,直接在培养箱中按5% CO2和37 °C条件培养1-1.5小时。
  4. 巨噬细胞生成培养基DXF完全版配制(第0天)。配制巨噬细胞生成培养基DXF(C-28055C-28056)时,将解冻的混合补充剂无菌加入基础培养基中。温和混匀。接着加入M1或M2细胞因子混合物。
  5. 贴壁细胞洗涤(第0天)。剧烈摇动组织培养器皿,松脱并吸除非贴壁细胞。用温热的单核细胞贴壁培养基(C-28051)洗涤贴壁细胞(即单核细胞)三次,每次加入培养基后摇动培养器皿再吸除上清。
  6. 巨噬细胞分化开始(第0天)。加入适量的完全版M1或M2-巨噬细胞生成培养基DXF(C-28055C-28056),例如,20 ml/T75培养瓶,37 °C和5% CO2培养6天,不更换培养基。
  7. 分化继续(第6天)。再加入50%-75%(体积比)的新鲜完全版M1或M2-巨噬细胞生成培养基DXF(C-28055C-28056)。在37 °C和5% CO2下,再培养未成熟巨噬细胞3天。
  8. 可选步骤:巨噬细胞激活(第7天)。如要进行特定的巨噬细胞激活,用户应根据需要在培养物中添加充足的刺激物。勿更换培养基,加入激活因子即可。通过明确刺激物激活巨噬细胞的实例:如需获得经典激活的M1型巨噬细胞,可向M1巨噬细胞加入IFN-γ(50 ng/ml)和LPS(10 ng/ml)。加入20 ng/ml IL-4可获得M2巨噬细胞的M2a亚型。免疫复合物和IL-1β或LPS可诱导M2b亚型,IL-10、TGFβ或糖皮质激素可诱导M2c亚型。用IFN-γ和LPS激活M2巨噬细胞可获得另一种类型的M1激活巨噬细胞[2]。
  9. 培养基更换(第9天)。吸出含悬浮细胞的培养基,放入离心管中。紧接着向培养物加入新鲜的完全版PromoCell巨噬细胞生成培养基DXF(C-28055C-28056)(已添加适合的细胞因子/激活因子)。将离心管细胞在350 x g下室温离心15 min。弃上清,用少量新鲜培养基小心重悬细胞。将离心管重悬细胞重新加入已补充新鲜培养基的贴壁培养物中。37 °C和5% CO2下再培养1天。
  10. 巨噬细胞已准备就绪(第10天)。培养器皿中的巨噬细胞现可直接使用,例如,可直接用于吞噬试验。每周更换新鲜的完全版巨噬细胞生成培养基DXF(C-28055C-28056),最多可维持培养三周。 
巨噬细胞激活表

结果

人PBMC来源M1巨噬细胞的形态和吞噬活性。

图 2.人PBMC来源M1巨噬细胞的形态和吞噬活性。A)PromoCell巨噬细胞生成培养基DXF接种24小时后,M1巨噬细胞的相差显微(Phase bright,明反差)图像。B) PromoCell冻存M1巨噬细胞吞噬大量荧光标记大肠杆菌。

人PBMC来源M2巨噬细胞的形态和吞噬活性。

图 3.人PBMC来源M2巨噬细胞的形态和吞噬活性。A)PromoCell巨噬细胞生成培养基DXF接种24小时后,M2巨噬细胞的相差显微图像。B) PromoCell冻存M2巨噬细胞吞噬大量荧光标记大肠杆菌。

PromoCell巨噬细胞生成培养基DXF培养第10天的M1和M2巨噬细胞的流式细胞分析。

图 4.PromoCell巨噬细胞生成培养基DXF培养第10天的M1和M2巨噬细胞的流式细胞分析。将新鲜的外周血单个核细胞(PBMCs)接种在单核细胞贴壁培养基中。获得的纯化单核细胞分化10天(不进行选做的激活步骤)。经表型标志物分析,M1巨噬细胞呈CD68+(99%阳性)和CD80+(83%阳性),M2巨噬细胞呈CD68+(99%阳性)和CD163+(95%阳性)。

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参考文献

1.
Murray PJ, Wynn TA. 2011. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11(11):723-737. https://doi.org/10.1038/nri3073
2.
Murray PJ, Wynn TA. 2011. Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. Journal of Leukocyte Biology. 89(4):557-563. https://doi.org/10.1189/jlb.0710409
3.
Gordon S. 2003. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3(1):23-35.
4.
Khramtsova G, Liao C, Khramtsov A, Li S, Gong C, Huo D, Nanda R. 2009. The M2/Alternatively Activated Macrophage Phenotype Correlates with Aggressive Histopathologic Features and Poor Clinical Outcome in Early Stage Breast Cancer.. https://doi.org/10.1158/0008-5472.sabcs-09-107
5.
Menzies FM, Henriquez FL, Alexander J, Roberts CW. Sequential expression of macrophage anti-microbial/inflammatory and wound healing markers following innate, alternative and classical activation. 160(3):369-379. https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2009.04086.x
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