简介

磷酸钙转染是将DNA导入真核细胞的常用方法。该技术已在多种细胞类型中获得了瞬时1并且稳定2的转染。该方法是基于将含有磷酸钠的HEPES缓冲盐水和含有DNA的CaCl2溶液进行缓慢混合实现的。所形成的DNA-磷酸钙共沉淀物可粘附于细胞表面,并可能通过胞吞作用被细胞吸收。甘油休克可以增加某些细胞类型的DNA摄取。

提供的试剂

该试剂盒中所提供的试剂均已通过0.2 μM过滤器灭菌并通过无菌填充。该试剂盒可供:

  • 在10厘米的培养皿上进行80次转染
  • 或者在6厘米的培养皿上进行160次转染(约25×6孔板)
  • 或者在3.5厘米的培养皿上进行400次转染(约36×12孔板)

磷酸钙转染试剂盒包含以下内容物:

  • 1瓶2.5M CaCl2(货号C2052
  • 1瓶(25 mL)分子生物级水(货号W4502
  • 1瓶(25 mL)2x HEPES缓冲盐水,pH 7.05(货号H1012)
    50 mM HEPES,280mM NaCl,1.5mM Na2HPO4

储存方法

所有组分应储存在-20 °C 在使用前,请将所有试剂盒组分解冻并平衡至室温。

操作流程

下述方法适用于用将1 μg/μL pSV40-CAT质粒(在无菌分子生物级水中稀释)转染至CHO细胞。在适合细胞类型的标准含血清或无血清培养基中进行细胞培养。该过程不推荐使用抗生素。应使用良好的无菌技术,并且仅使用无菌材料进行操作。

DNA质粒应该是高质量的,经乙醇沉淀,并重悬于分子生物级水中,终浓度为1μg/μL。

该实验步骤可经优化用于各种细胞类型。其中接种密度、使用的DNA量、孵育时间以及甘油休克,均可在需要时进行修改以实现更高的表达和更低的毒性。

第一天:接种细胞 按照下表进行细胞接种:

第二天:转染

  1. 请根据下表添加新鲜的完整培养基,以进行细胞转染准备:

2.两小时后,按下述操作在两个试管中制备转染试剂:

3.将移液器泵连接至装有200uL移液头的1mL血清移液管上,并使用该自动移液器泵对HeBS(管B)鼓泡。

4.在鼓泡HeBS(管B)的同时,逐滴添加管A(来自步骤2)的内容物。

5.涡旋2 - 4秒。

6.随后,让沉淀物静置20分钟。

7.将溶液均匀地滴在孔板中的细胞培养基上。轻轻搅动培养皿,使沉淀物均匀分布在培养皿中的细胞上。

8.将细胞孵育过夜(约16小时)。

第三天:甘油休克(可选)

  1. 将以下物质在离心管中混合:

2.从培养皿中取出培养基并更换甘油溶液。孵育2分钟。

3.移除甘油溶液,并用PBS洗涤两次:

第三天:更换培养基

  1. 在过夜孵育(或选择甘油休克)后,吸出培养基(或PBS)并用完全培养基进行替换。
  2. 将细胞孵育48小时。
  3. 收集并裂解细胞 - 它们已可用于其他应用。
材料
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参考文献

1.
Graham F, van der Eb A. 1973. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52(2):456-467. http://dx.doi.org/10.1016/0042-6822(73)90341-3
2.
Wigler M, Pellicer A, Silverstein S, Axel R. 1978. Biochemical transfer of single-copy eucaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell. 14(3):725-731. http://dx.doi.org/10.1016/0092-8674(78)90254-4