GenElute™细菌基因组DNA试剂盒实验方案
(NA2100、NA2110、NA2120)

GenElute™细菌基因组DNA试剂盒描述

我们的GenElute™细菌基因组DNA试剂盒提供了一种从各种培养细菌中分离纯DNA的简便方法。该试剂盒包含从革兰氏阴性细菌中分离和纯化基因组DNA所需的所有试剂。对于大多数革兰氏阳性细菌,该试剂盒必须与选购的溶菌酶(L4919)一起使用,以有效裂解厚的肽聚糖细胞壁。为了方便制备溶菌酶原液,我们提供了一种稀释的革兰氏阳性裂解溶液。

GenElute™试剂盒将硅胶膜系统的优势与微量离心形式结合在一起,同时无需采用昂贵的树脂、乙醇沉淀、以及诸如苯酚和氯仿等有害有机化合物。细菌首先在含有高离液盐的溶液中裂解,以确保大分子彻底变性。之后加入乙醇,当裂解物在微量离心管中离心到硅胶膜上时,DNA结合到膜上。在洗涤去除污染物后,将DNA在200 μL的Tris-EDTA溶液中洗脱。

预期的基因组DNA得率取决于细菌培养物的细胞密度、细菌种属以及所用的菌株。附录2列出了从一些革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中纯化的基因组DNA的典型得率。经GenElute™试剂盒纯化的 DNA 的A260/A280比值在1.6和1.9之间,长度可达50 kb。所得DNA可以用于各类下游应用,包括限制性核酸内切酶消化、PCR和南方印迹。

需要但未提供的仪器和试剂

  • 37°C水浴或加热块
  • 55°C水浴或加热块
  • 移液器吸头(建议使用气溶胶阻隔)
  • 1.5 mL微量离心管,用于裂解
  • 微量离心机(2 mL管,装有转子)*
  • 乙醇(95%-100%),货号E7023、E7148或459836
  • 分子生物学试剂水,货号W4502
  • 溶菌酶,货号L4919(仅用于革兰氏阳性)
  • 变溶菌素,货号M9901(仅用于链球菌
  • 溶葡球菌酶,货号L7386(仅用于葡萄球菌

注意:为了确保所有试剂管的正确放置,建议使用 24 位转子。如果您使用的是36位转子,我们建议每隔一个位置放一个管。

储存方法和稳定性

室温储存试剂盒。如果任何试剂盒试剂形成沉淀物,请以 55–65°C 温热,直到沉淀物溶解,并在使用前冷却至室温。

制备说明

  1. 将水浴或加热块预热至55 °C
    适用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。

  2. 将水浴或加热块预热至37 °C
    仅适用于革兰氏阳性菌。
  3. 彻底混合试剂
    检查试剂是否有沉淀。如果试剂盒的任何试剂发生沉淀,加热至55-65°C,直至沉淀物溶解,然后在使用前冷却至室温。

  4. 稀释洗液浓缩液
    用 10 mL(10 份制备包)、80 mL(70 份制备包)或 360 mL(350 份制备包)95-100%乙醇稀释浓缩液。每次使用后,盖紧稀释的清洗液,以防乙醇蒸发。
  5. 重构蛋白酶K
    根据表1,将一瓶蛋白酶K干粉溶于水,得到20 mg/mL原液。蛋白酶K溶液可在2-8℃下保存数天。若要保存更长时间,溶液中未使用的部分
    可在–20°C条件下等分保存至需要之时。所提供的原样产品在室温下稳定。

    注意:每次必须将蛋白酶K溶液直接添加到每个样品中。请勿将蛋白酶K溶液与裂解液混合保存。
表1蛋白酶 K 溶液制备
  1. 制备溶菌酶溶液仅适用于革兰氏阳性菌
    使用所包含的革兰氏阳性裂解液(L7539)作为稀释剂,制备2.115 × 106单位/mL溶菌酶(L4919)原液(约45 mg/mL)。例如,如要制备1 mL溶菌酶溶液,将2.115 × 106单位的溶菌酶溶解在1 mL革兰氏阳性裂解液中。

    上下吸移混合物或涡旋,以溶解溶菌酶(参见下面的注释)。对于要进行的每种DNA制备,需要200 μL溶菌酶溶液。需要多制备一些溶液,以弥补移液错误。 溶菌酶溶液应在制备后当天用完。

    注意:溶菌酶可以通过上下吸移混合物而不是涡旋更容易溶解。过度涡旋容易起泡。这可造成溶菌酶不易溶解,在这种情况下,不需要在使用前使其完全溶解。基因组DNA得率不会受影响,因为溶菌酶在37°C下孵育期间会溶解。

操作流程

如果在下游应用中需要最小剪切基因组 DNA,例如,如果使用最终产物进行长扩增 PCR,则通过温和移液或倒置混合至均匀,而不是在随后的程序中振荡。附录1列出了g-力至RPM的转换。

A. 革兰氏阴性细菌的制备

1a.收获细胞
12,000-16,000 ×g离心2分钟,以沉淀1.5 mL过夜细菌肉汤培养物。完全去除培养基并丢弃。
注意:如果细菌在富含营养的培养基如极品肉汤(T9179)中繁殖,则须将起始材料的体积减少至0.5 mL过夜细菌肉汤培养物,以免使GenElute™柱过载。有关更多信息,请参见附录2。

2a.重悬细胞
将沉淀重悬于180 μL裂解液T或者GenElute™哺乳动物基因组DNA试剂盒(B6678)的缓冲液STL中。如果不担心残留RNA,则直接前往执行步骤3a。
可选的RNase处理:如果需要无RNA的基因组DNA,则加入20 μL RNase A溶液,在室温下孵育2分钟,然后前往执行步骤4b。

3a.准备裂解细胞
向样品中加入20 μL蛋白酶K溶液。混合并在55℃下孵育30分钟。

4a.裂解细胞
加入200 μL裂解液C(B8803),彻底涡旋(约15秒),并在55 ℃下孵育10分钟。
均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。
继续步骤 5。

B. 革兰氏阳性细菌的制备

1b.使用鸡蛋白溶菌酶制备溶菌酶溶液(L4919)
按照制备说明,制备2.115× 106单位/mL溶菌酶原液。对于要进行的每种DNA制备,需要200 μL溶菌酶溶液。需要多制备一些溶液,以弥补移液错误。
注意:注意:如果用的是葡萄球菌,则用200单位/mL溶葡球菌酶(L7386)补充溶菌酶溶液。对于链球菌,则用250单位/mL变溶菌素(M9901)补充溶菌酶溶液。

2b.收获细胞
12,000-16,000 × g离心2分钟,以沉淀1.5 mL过夜细菌肉汤培养物。完全去除培养基并丢弃。
注意:如果细菌在富含营养的培养基如极品肉汤(T9179)中繁殖,则须将起始材料的体积减少至0.5 mL过夜细菌肉汤培养物,以免使GenElute™柱过载。有关更多信息,请参见附录2。

3b.重悬细胞
将沉淀重悬于200 μL溶菌酶溶液(步骤1b中制备)中,并在37 ℃下孵育30分钟。
可选的RNase A处理:如果不用担心残留RNA,可继续步骤4b。如果需要无RNA的基因组DNA,则加入20 μL RNase A溶液,在室温下孵育2分钟,然后前往执行步骤4b。

4b.裂解细胞
向样品中加入20 μL蛋白酶K溶液,然后加入200 μL裂解液C(B8803)。彻底涡旋(约15秒),并在55℃下孵育10分钟。均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。继续步骤 5。

从革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中分离DNA
这是在步骤1-4a和/或步骤1-4b中制备了裂解物之后的后续操作。

5.准备色谱柱
在每个预组装的GenElute™ Miniprep结合柱(带有红色O形环,不要与其他GenElute™试剂盒混淆)中加入500 μL柱准备液,置于2 mL收集管中。12,000 × g离心1分钟。丢弃洗脱液。
注意:柱制备溶液可最大限度地提高DNA与膜的结合,从而获得更稳定的产量。

6.准备结合
向裂解物中加入200 μL乙醇(95-100%),并涡旋5-10秒充分混合。确保混合均匀。

7.加载裂解物
将管中的全部内容物转移到结合柱中。在将内容物转移到色谱柱中时,使用广口移液器吸头,以减少对DNA的剪切。≥ 6500 × g离心1分钟。丢弃含有洗脱液的收集管,并将柱置于新的2 mL收集管中。

8.第一次洗涤
向柱中加入500 μL洗涤液液(W0263),并以≥6500 x g的转速离心1分钟。弃去含有流通液的收集管,将吸附柱置于新的2 mL收集管中。

9.第二次洗涤(重要提示:确保洗涤溶液浓缩液中已加入乙醇。)
向柱中加入500 μL洗涤液,并以最大速度(12,000-16,000 × g)离心3分钟以干燥吸附柱。在洗脱DNA之前,柱中不得含有乙醇。
如果看到有乙醇残留,则以最大速度将柱额外离心1分钟。如果您需要此额外的离心步骤,您可以清空并重新使用采集管。最后,丢弃含有洗脱液的收集管,并将柱置于新的2 mL收集管中。

10.洗脱DNA
移取200 μL洗脱液(B6803)直接到柱中心,以≥ 6500 × g离心1分钟以洗脱DNA。为了提高洗脱效率,在加入洗脱液后在室温下孵育5分钟,然后离心。
可选: 重复步骤10进行第二次洗脱,用另外的200 μL洗脱液,洗脱到新的2 mL收集管,或洗脱到第一洗脱所使用的2 mL收集管中。通过进行第二次洗脱,得率可提高20-50%。

洗脱液含有纯基因组DNA。DNA可短期储存于2-8°C下。
如要长期保存,建议储存于-20°C下。避免冻融,以免引起DNA链断裂。洗脱液将有助于在这些温度下稳定 DNA。

用GenElute™细菌gDNA试剂盒分离的细菌gDNA的PFGE。

图 1.用GenElute™细菌gDNA试剂盒分离的细菌gDNA的PFGE。

使用GenElute™细菌基因组DNA试剂盒从各种细菌中分离纯化的基因组DNA。使用BioRad CHEF DRII系统,将来自各个细菌样品的1 μg等分DNA试样,在0.5 X TBE中的1%琼脂糖凝胶上,在150伏下分离16小时。初始脉冲时间为2秒,最终脉冲时间为13秒,启动比为1.0,泵速设定为70,PFGE在4 °C下进行。M代表0.1-200 kb脉冲标记(货号D2291)。

泳道

  1. 大肠杆菌
  2. 荧光假单胞菌
  3. 枯草芽孢杆菌

结果

基因组DNA的浓度和质量可通过分光光度分析和琼脂糖凝胶电泳确定。在TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0-8.5)中稀释DNA,使用石英微量比色皿测量260 nm、280 nm和320 nm处的吸光度。260 nm和280 nm处的吸光度应介于0.1与1.0之间(或在分光光度计的线性范围内)。320 nm吸光度用于校正背景吸光度。260 nm处的吸光度1.0对应于约50 μg/mL双链DNA。A260–A320/A280–A320比例应为1.6-1.9。
DNA的尺寸和质量可以通过琼脂糖凝胶电泳法来确定。1 含有 0.8%琼脂糖的凝胶(A9539)置于0.5X TBE缓冲液(T6400)中对于基因组DNA的解析效果非常好。溴化乙锭(E1510)之类的嵌入染料可用来观察DNA,并对比已知的DNA标记物,例如λ-DNA Hind Ⅲ消化物(D9780),进行测量。基因组DNA应作为单一的高分子量条带迁移,几乎没有剪切迹象。脉冲场凝胶电泳法可以
更精确地测定DNA的尺寸。2

故障排除

附录1

注意:所有转速都是以g为单位的。有关将g-力转换为RPM的信息,请参阅表2。如果没有所需g力的离心机 / 转子,请尽可能使用最大g力,并按比例增加离心时间。离心直至所有液体通过色谱柱。

表2.常用转子的离心力(以g为单位)转换为RPM的转换表

有关所选常用离心机和转子的转速(RPM),请参见上表。可以使用以下公式计算未列出的转子的正确RPM:

rpm

式中:RCF = 所需的重力加速度(相对离心力),单位为g; r = 转子半径,单位为cm; RPM = 达到所需g力所需的每分钟转数

附录2

表3.GenElute™细菌基因组DNA试剂盒的典型DNA产量

注意事项和免责声明

GenElute™细菌基因组DNA试剂盒仅供研发使用,不适用于药物、家庭或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据说明书。

GenElute是Sigma-Aldrich Co. LLC的商标。

材料
Loading

参考文献

1.
Sambrook, JF, Russell, D. ( 2001).. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY:
2.
BIRREN B, LAI E. 1993. FIELD INVERSION GEL ELECTROPHORESIS.121-128. http://dx.doi.org/10.1016/b978-0-12-101290-8.50011-0