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FFPE 组织

存档的福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE) 组织样本是分析基因表达和研究多种疾病的宝贵资源。由于存档的 DNA 通常数量有限,因此样本的扩增必不可少。由于存档过程导致模板损坏,放大 FFPE 组织可能是一项艰巨的任务。该方案为从 FFPE 组织中纯化和扩增基因组 DNA 提供了方便的方法。GenomePlex®全基因组扩增已用于扩增大鼠和人类FFPE组织样本的基因组DNA。

注意:以方案描述了 DNA 纯化和随后的全基因组扩增的过程。我们已通过我们的GenomePlex组织全基因组扩增试剂盒(货号WGA2+C4482)极大简化了这一过程。该试剂盒包括用于组织破碎和细胞裂解的优化试剂,无需繁琐的有机提取过程,可在扩增前去除多余的石蜡或 DNA 纯化过程。

所需产品

  • GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 小量制备试剂盒(产品编号:G1N10)

由用户提供的材料

  • FFPE 组织
  • 37 °C 水浴或加热块
  • 55 °C 水浴或加热块
  • 70 °C 水浴或加热块
  • 二甲苯
  • 乙醇(产品编号E7023)
  • 水,分子生物学试剂(产品编号W4502)
  • 微量离心机(带2 mL管的转子)

从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中提取DNA
该方案是在大鼠肝组织上进行的。
建议在该过程中使用GenElute哺乳动物基因组DNA小量制备试剂盒(货号G1N10)。

  1. 将一小段 (20 mg) 石蜡包埋组织放入到2 mL微量离心管中。
  2. 加入1200 µL二甲苯,涡旋30秒。
  3. 室温全速离心 5 min。
  4. 移液除去上清液。切勿取出任何颗粒。
  5. 向沉淀中加入1200 µL乙醇以除去残留的二甲苯。涡旋混匀。
  6. 室温全速离心 5 min。
  7. 小心移液除去乙醇。切勿取出任何颗粒。
  8. 再次重复步骤 5-7。
  9. 将开放的微量离心管在 37°C 培养 10-15 min,通过蒸发除去任何残留的乙醇。
  10. 消化组织:将组织块重悬于180 µL裂解液T中。
  11. 加入20 µL蛋白酶K。通过涡旋混合。在 55 °C 下培养过夜或直至组织完全裂解。在孵化过程中偶尔涡旋。
    可选的RNase处理:如果担心残留RNA,可加入20 µL RNase A溶液,室温孵育2 min。
  12. 裂解细胞:涡旋 15 秒。向样品中加入200 µL裂解液C。对于均匀混合物的彻底涡旋对于有效裂解是必不可少的。在70 °C孵育10分钟。
  13. 准备色谱柱:向每个预装GenElute微量提取吸附柱中加入500 µL柱制备液,12,000× g离心1分钟。
  14. 结合准备:向裂解的样品中加入200 µL乙醇,涡旋混匀。
  15. 加裂解液:从步骤 14 开始将样品管的全部内容物转移到处理过的吸附柱中。 ≥6500 × g离心1分钟。弃去含有流通液的收集管,将吸附柱置于新的2 mL收集管中。
  16. 第一次清洗:首次使用前,请按照配制说明书的说明用乙醇稀释洗涤液浓缩液。向吸附柱中加入500 μL洗涤液,并以 ≥6500 × g的转速离心1分钟。弃去含有流通液的收集管,将吸附柱置于新的2 mL收集管中。
  17. 第二次洗涤:向吸附柱中再加入500 µL洗涤液,并以最大速度(12,000–18,000 × g)离心3分钟以干燥吸附柱。在洗脱柱上的 DNA 之前,吸附柱不含乙醇至关重要。如果看到残留乙醇,以最大速度将吸附柱再离心一分钟。弃去含有流通液的收集管,将吸附柱置于新的2 mL收集管中。
  18. 洗脱 DNA:将200 µL洗脱液直接移入吸附柱中心,室温孵育5 min。≥6500 × g离心1分钟以洗脱DNA。
  19. 将DNA样品储存在–20°C。
    注:从第 10 步开始,无需使用二甲苯即可执行此方案。由于省略了二甲苯处理步骤,与采用二甲苯步骤的方案相比,DNA 的量将减少约 50%。

应用数据

GenomePlex 全基因组扩增 FFPE 组织

基因组扩增试剂盒

图标符号:产物是通过使用来自我们的GenomePlex全基因组扩增试剂盒(货号WGA1)、供应商A和供应商Q分别扩增得到的。在1.5%琼脂糖凝胶上分离产物。向每孔中加入5 µL扩增产物。与供应商 A 和 Q 相比,使用 GenomePlex 技术扩增的产物分子量较小,这归因于扩增前基因组 DNA 的随机片段化。我们的扩增产物是特异性的,在阴性对照中没有可见的扩增子(泳道 2),表明只有所需的基因组 DNA 被扩增。供应商 A 和 Q 在阴性对照中产生非特异性信号,其大小和强度与供应商阳性对照的信号相等。

泳道 1—1kb 标记泳道 6—供应商 A 10 ng 输入 DNA
泳道2—我们的阴性对照泳道7—供应商 A 100 ng 输入 DNA
泳道3—我们的 10 ng 输入 DNA泳道8—供应商 Q 阴性对照
泳道4—我们的 100 ng 输入 DNA泳道9—供应商 Q 10 ng 输入 DNA
泳道5—供应商 A 阴性对照泳道10—供应商 Q 100 ng 输入 DNA
DNA是用KAPA Express Extract从来自哺乳动物和鱼的多个样品中提取得到的。

图标符号:从福尔马林固定和石蜡包埋的大鼠肝脏样本中提取 DNA。10 ng和100 ng的基因组DNA是通过使用GenomePlex Complete WGA试剂盒(货号WGA2)扩增并然后用GenElute PCR纯化试剂盒(货号NA1020)纯化得到的。使用 12 种不同的引物组对 WGA 反应进行定量 PCR(45 个循环)。与供应商相比,GenomePlex 表现出约 1000 倍 (10 Ct) 更好的代表性。

材料
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