本实验方案描述了Duolink® PLA试剂用于组织和细胞样品中个体蛋白质、蛋白质修饰和蛋白质相互作用的明场检测、可视化和定量。如想了解Duolink® PLA技术,请下载我们的手册并查阅如何优化Duolink® 邻位连接测定以获得更多详细信息。如需更多实验方案,可参阅Duolink® PLA荧光实验方案和Duolink® PLA Probemaker用户指南。

材料和设备
Duolink®PLA明场实验方案
结果
故障排除
材料
参考文献

材料和设备

Duolink® PLA试剂

有关具体的产品建议,请参阅Duolink® PLA产品选择指南。简单来说,要运行用于明场检测的Duolink® PLA实验,需要以下Duolink® PLA产品:

  1. Duolink® PLA探针(一种PLUS和一种来自不同物种的MINUS,与您的一抗宿主物种相匹配)。每个试剂盒包括:
    a)PLA探针 — PLUS和/或MINUS,取决于产品。
    b)封闭溶液 — 用于在孵育抗体前封闭样品。一滴封闭溶液约等于40 µL。
    c)抗体稀释液 — 用于稀释PLA探针和必要时的一抗。
    说明:将所有组分储存在4°C。

    注:如果需要,可用Duolink® PLA
    Probemaker PLUS或Probemaker MINUS生成定制的PLA探针。有关详细信息,请参阅Probemaker指南。

  2. 用于明场的Duolink®检测试剂。每个试剂盒含有两包,包含以下内容:
    A盒(储存在-20°C):
    a) 连接缓冲液原液(5x) – 稀释成1x连接缓冲液
    b) 连接酶(1 U/µL) – 加入制成连接溶液
    c) 扩增缓冲液原液(5x) – 稀释成1x 扩增缓冲液
    d) 聚合酶(10 U/µL) - 加入制成扩增溶液
    e) 检测缓冲液原液(5x) – 稀释成1x 检测缓冲液
    B盒(储存在4°C):
    a) 过氧化氢 – 用于淬灭内源性的过氧化物酶活性
    b) 底物试剂A-D – HRP酶促反应所需
    c) 核染液 – 用于复染

  3. 用于明场的洗涤缓冲液(洗涤缓冲液A)

其他材料

  1. 载玻片上的样品(细胞或组织),经过固定、透化、脱蜡和(或)抗原修复的预处理。关于下列主题的相关建议和详细信息,请参阅如何优化Duolink®邻位连接测定:
    a)实验设计和对照 b)选择一抗和优化 c)样品处理

  2. 检测目标蛋白质的一抗。当与Duolink® PLA探针一起使用时,必须在小鼠、兔子或山羊中饲养。
  3. 高纯水(无菌过滤,Milli-Q®产水或类似水质)
  4. 二甲苯 – 用于在非水性封片剂中进行封片前脱水
  5. 乙醇 – 用于在非水性封片剂中进行封片前脱水
  6. 适用于IHC染色玻片的非水性封片剂(如用于组织学的DPX封片剂)

设备

  1. 带有可进行图像采集的相机和软件的明场显微镜
  2. 37°C培养箱
  3. 摇床
  4. 加热的湿度箱
  5. 疏水笔,用于画出反应区域
  6. 冷冻座(用于酶)
  7. 染色罐
  8. 镊子
  9. 移液器和洗头(从1 µL至1,000 µL)
  10. 盖玻片 24x50 mm,#1.5

Duolink® PLA明场实验方案

以下实验方案适用于载玻片上的1 cm2样品,需要40 μL溶液以充分覆盖。根据您的反应面积和样品数量调整体积。所有孵育均应在湿度箱中进行。 所有洗涤步骤均应在室温下在含有至少70 mL缓冲液的染色罐中进行,并伴有轻轻搅动。

制备试剂

  1. 洗涤缓冲液A应在开始测定之前制备,将一小袋内容物溶解在高纯度纯水中,定容1,000 mL。溶液可在室温短期(最长两周)储存或 4°C长期储存。
    说明:使用前将溶液升温至室温。

  2. 许多Duolink® PLA试剂以浓缩原液形式提供,在使用前立即稀释。请勿储存稀释后的Duolink® PLA试剂。

Duolink® PLA明场实验方案

在开始前,样品应存放在载玻片上,并经过固定、透化、脱蜡和(或)抗原修复的预处理。有关详情,请参阅如何优化Duolink®邻近连接测定。

  1. 过氧化物酶淬灭
    注意:将组织样品孵育在过氧化氢中以抑制内源性的过氧化物酶活性。孵育时间因组织类型而有所不同,因此需要用户进行优化。
    a) 用疏水性笔在玻片上圈出反应区域。这在整个实验方案中可能需要多次重复。当需要时就重新操作。
    b) 滴加1滴(~40 μL)过氧化氢在每1 cm2样品上。确保覆盖住整个样品。可相应进行调整。
    c) 根据您的细胞或组织类型将载玻片在室温孵育适当的时间。
  2. 封闭
    a) 将过氧化氢溶液从玻片上弹掉。
    b) 在室温下的1x洗涤缓冲液A中洗涤玻片2x 5分钟。
    c) 涡旋Duolink®封闭溶液。
    d) 滴加1滴(~40 µL)Duolink®封闭溶液至每1 cm2样品上。确保封闭溶液覆盖了整个样品。
    e) 将玻片置于湿度箱中在37℃孵育60分钟。
  3. 一抗孵育
    注意:请勿在加入一抗前让玻片变干,否则会增加背景信号。

    a) 涡旋Duolink®抗体稀释液。
    b) 在Duolink®抗体稀释液中稀释一抗或抗体至合适浓度。 c) 从载玻片上弹掉Duolink®封闭溶液 d) 将一抗溶液添加到每个样品中。 e) 将载玻片置于湿度箱中孵育。用最佳孵育温度和时间孵育一抗。
  4. 孵育Duolink® PLA探针
    a) 涡旋PLUS和MINUS PLA探针。
    b) 在Duolink®抗体稀释液中以1:5稀释PLUS和MINUS PLA探针。
    对于40 μL反应,取8 μL PLA探针MINUS原液、8 μL PLA探针PLUS原液和24 μL抗体稀释液。
    为所有样品制备足量的溶液。

    c) 从载玻片弹掉一抗溶液。
    d) 在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 5分钟。 e) 弹掉多余的洗涤缓冲液,然后涂抹PLA探针溶液。 f) 将载玻片置于湿度箱在37℃孵育1小时。
  5. 连接
    注意:连接酶要等到需要添加到样品中时立即添加。确保连接缓冲液在使用前在室温完全解冻并充分混合。

    a) 用高纯度纯水以1:5稀释5x Duolink®连接缓冲液并混合。
    对于40 μL反应,将8 μL 5x连接缓冲液添加到32 μL高纯度纯水中。
    为所有样品制备足量的溶液。

    b) 从载玻片弹掉PLA探针溶液。 c) 在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 5分钟。 d)在洗涤过程中,使用冷冻座(-20°C)恢复从冻箱里取出的连接酶。 e) 以1:40稀释度将连接酶添加到步骤(a)中的1x连接缓冲液中,并混合。
    对于40 μL连接溶液,将1 μL连接酶添加至39 μL的1x连接缓冲液中。

    f) 弹掉多余的洗涤缓冲液,然后涂抹连接溶液
    g) 将载玻片置于预热的湿度箱在37℃孵育30分钟。
  6. 扩增
    说明#1:聚合酶要等到需要添加到样品中时立即添加。
    说明2:扩增时间会根据抗原修复过程而不同。对于热诱导的表位修复,扩增120分钟。对于酶诱导的抗原修复,扩增90分钟。其他情况扩增100分钟。

    a) 用高纯度纯水将5x扩增缓冲液以1:5稀释并混合。
    对于40 μL反应,将8 μL 5x扩增缓冲液添加到32 μL高纯度纯水中。
    为所有样品制备足量的溶液。

    b) 从载玻片弹掉连接溶液。
    c) 在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 2分钟。 d) 在洗涤过程中,使用冷冻座(-20°C)恢复从冻箱里取出的聚合酶。 e) 以1:80稀释度将聚合酶添加到步骤(a)中的1x扩增缓冲液中,并混合。
    对于40 μL扩增溶液,将0.5 μL聚合酶添加至39.5 μL的1x扩增缓冲液中。

    f) 弹掉多余的洗涤缓冲液,然后涂抹扩增溶液。
    g) 将载玻片置于湿度箱在37℃孵育90至120分钟,具体取决于抗原修复的方法(见上数说明#2)。
  7. Duolink®检测明场
    a) 从载玻片上弹掉扩增溶液。
    b) 在室温下在1x洗涤缓冲液A中将载玻片洗涤2x 2分钟。 c) 在洗涤过程中,用高纯度纯水以1:5稀释5x检测明场原液并混合。
    对于40 μL反应,将8 μL 5x检测明场原液添加到32 μL高纯度纯水中。
    为所有样品制备足量的溶液。 d) 弹掉多余的洗涤缓冲液,然后涂抹连接溶液。 e) 将载玻片置于湿度箱在37℃孵育60分钟。
  8. 底物显影
    注意:酶的显影时间:根据蛋白质表达水平和/或样品预处理条件不同,会有不同的底物沉淀。因此,用户需自行确定显影时间,但通常为2-15分钟。

    a) 从载玻片上弹掉检测溶液。 b) 在室温下在1x洗涤缓冲液A中将载玻片洗涤2x 2分钟。
    c) 在洗涤过程中,用高纯度纯水稀释底物试剂A(1:70)、B(1:100)、C(1:100)和D(1:50)并混合以制备底物溶液。
    对于40 μL反应,将0.6 µL底物A、0.4 µL底物B、0.4 µL底物C和0.8 µL底物D添加到37.8 μL高纯度纯水中。
    为所有样品制备足量的溶液。 d) 弹掉多余的洗涤缓冲液并加入底物溶液。 e) 根据样品将载玻片在室温孵育适当的时间。
  9. 核染液
    a) 从载玻片上弹掉底物溶液。
    b) 在室温下在2x洗涤缓冲液A中将载玻片洗涤2x 2分钟。 c) 滴加1滴(~40 µL)核染液至每1 cm2样品上。确保用核染液覆盖了整个样品。
    d) 将载玻片在室温孵育2分钟。
    e) 在流动的去离子水(非静态水)下冲洗载玻片10分钟。
  10. 脱水
    a) 在室温下在96% EtOH中孵育载玻片2x 2分钟。
    b) 在室温下在99.7% EtOH中孵育载玻片2x 2分钟。
    c) 在室温下在二甲苯中孵育载玻片10分钟。
    d) 将载玻片移至新鲜的二甲苯中。
  11. 成像准备
    注意:当使用提供的底物试剂时,请勿使用水性的封片剂。避免在盖玻片下留有气泡。

    a)弹去多余的二甲苯。
    b) 用一支盖玻片以及最少体积的非水性IHC兼容型封片剂,如用于组织学的DPX封片剂对载玻片进行封片。
    c) 让玻片晾干。
    d) 用明场显微镜在至少20x物镜下进行分析。
    e) 成像后将玻片存放在室温。PLA信号可稳定保存数年。

结果

图像采集

利用明场显微镜对Duolink® PLA明场实验的结果进行观察。Duolink® PLA明场信号在被研究细胞或组织样品的多个位置被识别为离散的红褐色斑点(图1A)。蓝色为核复染结果。偶尔也会观察到弥散的淡褐色染色,这可能是由于存在未被淬灭的内源性过氧化物酶活性。该染色也会出现在阴性对照(无一抗)样品中。真正的PLA信号是亚微米尺寸的,并可能出现在多个焦平面中。因此,可通过改变焦点使其出现和消失来“充分扫描”各个PLA信号。然而,这在信号过密以至于信号发生重合时不适用,例如在研究高表达蛋白时(图1B)。

乳腺癌FFPE组织中的HER2受体和HER2/HER3异二聚体检测

图 1.使用Duolink® PLA明场检测FFPE乳腺癌组织中的HER2受体和HER2/HER3异二聚体。(A) 采用抗-HER2和抗-HER3一抗进行Duolink® PLA,它们经优化可产生单独的PLA信号,显示HER2/HER3的相互作用。(B) 仅采用抗-HER2一抗进行Duolink® PLA。由Pantomics Inc.通过IHC而评分为2+的HER2受体丰度可导致PLA信号的重合。(C) 阴性对照(无一抗)。PLA信号显示为红褐色;核为蓝色。

明场图像通常拍摄在同一焦平面中。为了减少未聚焦的PLA信号数量,请使用数值孔径较大的物镜。在实验中,使所有样本之间的光强度、曝光时间、阴影校正/白平衡等所有设置保持恒定非常重要。应将光强度与曝光时间结合设置以实现正确的曝光平衡。关于如何防止信号重合以及其他可能的优化方面,请参阅Duolink® PLA故障排除指南获取相关建议。

图像分析

用于免疫组织化学图像分析工具同样也可用于量化PLA信号。在确定阈值后,可使用传统的明场分析软件通过点强度测量或带有信号的样品面积积分来实现最好的图像数据分析。可获取每张图像的信号和细胞数量进行平均测量,或将每个信号分配给特定的细胞进行单细胞分析。

故障排除

请参阅Duolink® PLA故障排除指南查找故障排除的提示和技巧、一般故障排除说明、以及常见问题解答。

请随时联系我们的技术支持团队或当地销售代表以获得实验方面的帮助。

定制服务

您的实验是否需要额外的定制?让我们为您完成这项工作。请详细了解我们的定制服务计划,以加速您的Duolink® PLA项目。

材料
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参考文献

1.
Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. http://dx.doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200
2.
Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth947
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Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0400552101
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Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. http://dx.doi.org/10.1038/nbt0502-473