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酵母转化实验方法

介绍

酵母因能够快速生长并具有分散的细胞而被认为是用于真核生物研究的模范系统。此外,可以相对容易地完成酵母细胞的复制铺板和突变分离,并且它们也具有明确的遗传系统。最为重要的是,酵母具有高度多功能的DNA转化系统,可有效用于蛋白质的生产。

酵母转化

表1Sigma-Aldrich酵母转化产品

酵母转化实验方法

实验方法概览

LiAc转化方法涉及到三个主要的步骤:制备感受态酵母细胞、用质粒DNA进行转化以及随后的铺板以进行转化子选择。酵母转化子通常是通过使用营养缺陷型标记而进行选择的;因此,应使用合适的合成缺陷型培养基进行转化子筛选。

所需试剂:

储备溶液
50%聚乙二醇溶液(分子量~36,500)
1 M Tris-HCl和0.2 M EDTA,pH 8.0(TE缓冲液)(货号T9285)
1 M醋酸锂,pH 7.5(货号L4158)

1x TE-LiAc溶液
含1 mM EDTA和0.1 M醋酸锂的10 mM Tris-HCl,pH 8.0

PEG-TE-LiAc溶液
溶于含1 mM EDTA和0.1 M醋酸锂的10 mM Tris-HCl,pH 8.0的40 % PEG

酵母转化

  1. 制备YPD和合成完整(SC)缺陷型培养基平板,并分别对其进行高压灭菌(表1和2)。
  2. 从平板中挑取酵母细胞至在100 mL无菌烧瓶中的20 mL YPD培养基中。
  3. 过夜摇晃培养。
  4. 将上述培养物中的细胞进行稀释到100 mL YPD培养基中,直至OD600为0.3。
  5. 轻轻沉淀细胞。
  6. 用7-8 mL的1x TE-LiAc溶液进行重悬并在23 °C旋转1-1.5小时。
  7. 向转化专用的无菌微型离心管中加入10 µL的10 mg/ml鲑鱼睾丸DNA(货号D9156),另设置一组阴性对照。
  8. 向每管中加入0.1 µg的酵母质粒DNA(待研究的)以及100 µL的感受态细胞,并涡旋。
  9. 加入600 µL新鲜制备的PEG-TE-LiAc溶液,涡旋后在30 °C孵育30分钟,并轻轻摇晃。
  10. 可选 - 可加入10% (v/v)的DMSO(货号D8418);随后在42 °C热激15分钟。
  11. 离心3秒,用无菌水重悬细胞并使用适当的SC缺陷型培养基进行铺板。

注意:可参考铺板酵母的生长实验方法以及以下章节进行转化子分离。

酵母转化子的分离

酵母转化子通常是采用URA3互补法进行选择的,尽管也可以使用利用氨基酸进行互补的技术和蓝白斑筛选方法。

在基于URA3的选择技术中;质粒DNA通过都含有正常拷贝的酵母URA3基因以及URA3启动子;然而,酵母突变株缺乏URA3等位基因。因此,用质粒转化后的酵母细胞含有了URA3基因的功能性拷贝,使得它们能够在补充了尿嘧啶(货号Y1501)的酵母合成缺陷型培养基中进行生长。

图1.酵母转化

材料
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参考文献

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