用于核酸去磷酸化的小牛肠(CIP)碱性磷酸酶

(CIP)
来自小牛小肠 (EC 3.1.3.1) 货号P4978 –20 °C储存

产品描述 产品概要 存储缓冲液 操作步骤: DNA去磷酸化 热灭活 材料 参考文献

产品描述

CIP(Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal)常用于脱去DNA、RNA及核糖和脱氧核糖核苷三磷酸上的5’-磷酸基团。5’-磷酸的去除对于防止酶切载体DNA的自身连接是非常有用的。该特性极大降低了克隆步骤中的背景(没有片段插入的质粒)。

产品概要

活性:近10000单位/mL(见特定批次的活性标签)
DNA酶:未检出 切口酶:未检出 RNA酶:未检出 单位定义:一单位在37°C、pH 9.8条件下每分钟可水解1.0 µmol 4-硝基苯磷酸盐(二乙醇胺)。

10X CIP Buffer (C 3225)
1 M NaCl 0.5 M Tris-HCl pH 7.9,25 °C时 0.1 M MgCl2 0.01 M二硫苏糖醇

存储缓冲液

10 mM Tris-HCl, pH 8.2
50 mM KCl
1 mM MgCl2
0.1 mM ZnCl2
50 %甘油

操作程序:DNA去磷酸化

  1. 1X CIP缓冲液溶解DNA(0.5µg DNA/10µL)。
  2. 对于5’突出的粘末端DNA加入0.1单位/皮摩尔的CIP;对于3'突出的粘末端或布路姆试剂加入1单位/皮摩尔。
  3. 在37 °C孵育60分钟。
  4. 苯酚/氯仿(P3803或P2069)提取或凝胶纯化DNA。*
  5. 乙醇沉淀法恢复DNA。
    *注意:苯酚提取或凝胶纯化后无需再热灭活。

热灭活

在5mM EDTA中75°C加热10分钟,可使95%以上活性灭活。

材料
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参考文献

1.
Moessner E, Boll M, Pfleiderer G. 1980. Purification of Human and Bovine Alkaline Phosphatases by Affinity Chromatography. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 361(1):543-550. http://dx.doi.org/10.1515/bchm2.1980.361.1.543
2.
Sambrook, et al. J. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory.