TRI Reagent®有何作用?

TRI Reagent®溶液(也以TRIzol的名称出售)是硫氰酸胍和苯酚的单相溶液混合物,可用于从人、动物、植物、酵母、细菌和病毒生物样品中分离DNA、RNA和蛋白质。其可抑制RNase活性。TRI Reagent®用于匀浆提取RNA、DNA或蛋白质的生物样品。

操作流程

样品制备

1A. 组织:
在Polytron®或其他合适的均质器中,在TRI Reagent(每50-100mg组织1ml)中均质化组织样品。

注意:如果需要最小量的DNA剪切,请使用松散型均质器,而不是Polytron(参见DNA分离,步骤3,注释b)。组织的体积不应超过TRI Reagent体积的10%。

1B.单层细胞:
直接在培养皿上裂解细胞。每10 cm2玻璃培养板表面积使用1 ml TRI Reagent。加入试剂后,应使用移液管抽吸细胞裂解液数次,以形成均质裂解物。

注意:TRI Reagent与塑料培养板不兼容。

1C.悬浮细胞:
通过离心分离细胞,然后通过重复移液使其在TRI Reagent中裂解。1 ml试剂足以裂解5–10 × 106个动物、植物或酵母细胞或5–10 × 106个细菌细胞。

注意:

  • 如果样品的脂肪、蛋白质、多糖或细胞外物质含量高,例如肌肉、脂肪组织和植物的块茎部分,则可能需要 额外的步骤。均质化后,将匀浆12,000 × g、2-8℃离心10分钟以除去不溶物质(细胞外膜、多糖和高分子量 DNA)。上清液含有RNA和蛋白质。如果样品脂肪含量高,则应该除去水相表面上的一层脂肪物质。将澄清的上清液转移到新管中并继续进行步骤2。按照DNA分离步骤2和3从沉淀中回收高分子量DNA。
  • 一些酵母和细菌细胞可能需要均化器。
  • 将细胞在TRI Reagen中均质化或裂解后,可将样品在-70℃下储存长达1个月。

相分离:为确保核蛋白复合物完全解离,使样品在室温下静置5分钟。每ml TRI Reagent加入0.1ml 1溴-3氯丙烷或0.2ml氯仿(参见相分离,注释a和b)。紧紧盖住样品,剧烈摇动15秒,并在室温下静置2-15分钟。将所得混合物以12,000 × g、2-8℃离心15分钟。离心将混合物分成3个相:红色有机相(含有蛋白质),中间相(含有DNA)和无色上层水相(含有RNA)。

注意:

  • 1-溴-3-氯丙烷的毒性低于氯仿,用它进行相分离降低了DNA污染RNA的可能性。4
  • 用于相分离的氯仿不得含有异戊醇或其他添加剂。
  • 关于从水相中分离Poly A+组分的信息,请参见附录I。

RNA分离或提取

1.将水相上清液转移到新管中,每ml用于制备步骤1中的TRI Reagent加入0.5ml 2-丙醇,混合。让样品在室温下静置5-10分钟。在2-8℃下以12,000 × g离心10分钟。RNA沉淀在管的侧面和底部。

注意:将中间相和有机相储存在2-8°C,以备用于随后的DNA和蛋白质分离。

2.去除上清液,在每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent中至少加入1ml 75%乙醇来洗涤RNA沉淀。涡旋样品,然后在2-8°C下以7,500 × g离心5分钟。

注意:

  • 如果RNA颗粒漂浮,则以12,000 × g在75%乙醇中洗涤。
  • 样品可以在2-8°C下在乙醇中储存至少1周,在-20°C下储存长达1年。

3.通过风干或真空将RNA沉淀短暂干燥5-10分钟。不要让RNA沉淀完全干燥,否则会大大降低其溶解度。请勿在真空(Speed-Vac®)下离心干燥RNA沉淀。向RNA沉淀中加入适量的甲酰胺、水或0.5% SDS溶液。为了促进溶解,用微量移液管在55-60℃下反复吹打10-15分钟以混合。

注意:

  • RNA的最终制备液中不含DNA和蛋白质。它应该具有≥1.7的A260 / A280比率。
  • 组织的典型产率(mg RNA/mg组织):肝脏、脾脏:6-10mg;肾脏:3-4mg;骨骼肌、脑:1-1.5mg;胎 盘:1-4 mg。
  • 培养细胞的典型产率(mg RNA/10<sup>6</sup>细胞):上皮细胞:8-15mg;成纤维细胞:5-7mg。
  • 琼脂糖凝胶中RNA的溴化乙锭染色显示两条主要条带:小(2 kb)和大(5 kb)核糖体RNA,低分子量 (0.1–0.3 kb) RNA,以及高分子量(7-15 kb)RNA的离散条带。

DNA分离或提取

1.小心地去除与中间相重叠的水相并丢弃。为了从中间相和有机相中沉淀DNA,在每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent中加入0.3ml 100%乙醇。倒置混合并在室温下静置2-3分钟。在2-8℃下 2,000 × g离心5分钟。

注意:在DNA沉淀之前去除剩余的水相是保证分离DNA质量的关键步骤。

2.去除上清液,保存在2-8°C,以备进行蛋白质分离。用0.1M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀两次。对每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent使用1ml洗涤溶液。在每次洗涤期间,使DNA沉淀静置(偶尔混合)至少30分钟。在2-8℃下以2,000 × g离心5分钟。将DNA沉淀重悬于75%乙醇(每ml TRI Reagent1.5-2ml)中,并在室温下静置10-20分钟。

注意:

  • 重要提示:请勿缩短样品处于洗涤液中的时间。30分钟绝对是从DNA中有效去除苯酚所需的最短时间。
  • 如果沉淀团有> 200mg DNA或大量非DNA材料,则需要在0.1M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液中额外洗涤。
  • 悬浮在75%乙醇中的样品可以在2-8℃下储存数月。

3.在真空下将DNA沉淀干燥5-10分钟,并溶解于8mM NaOH中,用微量移液管反复缓慢移液混合。加入足量8mM NaOH,使最终DNA浓度为0.2-0.3mg / mL(对于从50-70mg组织或10<sup>7</sup>个细胞中分离的DNA,通常为0.3-0.6ml)。这种温和的碱性溶液可确保DNA沉淀完全溶解。以12,000 × g离心10分钟,以除去任何不溶物质,并将上清液转移到新管中。

注意:

  • 粘性上清液表明存在高分子量DNA。
  • DNA的大小取决于均质化过程中施加的力。避免使用Polytron均质器。
  • 溶解在8mM NaOH中的样品可以在2-8℃下储存过夜。如要长期储存,则将pH值调节至7至8之间,并补 EDTA(最终浓度1 mM)。
  • 要确定DNA浓度,取一份等分试样,用水稀释,并测量A260。对于双链DNA,1 A260单位/ml =50μg/ml
  • 为了计算细胞数,假设人、大鼠和小鼠的10<sup>6</sup个二倍体细胞的DNA量分别等于7.1μg、6.5μg和5.8μg。
  • 组织的典型产率(μg DNA/mg组织):肝脏、肾脏:3-4μg;骨骼肌、大脑和胎盘:2-3μg。
  • 培养的人、大鼠和小鼠细胞的典型产率:5-7μg DNA/106细胞。

用PCR扩增DNA

溶于8mM NaOH后,用HEPES调节至pH 8.4(加入86μL 0.1M HEPES 游离酸/ml DNA溶液)。将样品(通常0.1-1μg)加入PCR混合物中,并执行PCR实验方案。

用限制酶消化DNA

用HEPES将DNA溶液的pH调节至限制酶消化所需的pH,或者针对1mM EDTA、pH 7-8透析样品。在最佳条件下使限制酶消化继续3-24小时。建议每1μg DNA使用3-5单位的酶。通常,80-90%的DNA被消化。

蛋白质分离

1.每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent,用1.5ml 2-丙醇,从苯酚-乙醇上清液(DNA分离,步骤2)沉淀蛋白质(参见注释)。使样品在室温下静默至少10分钟。在2-8℃下以12,000 × g离心10分钟。

注意:对于某些样品,蛋白质沉淀可能难以溶解在1% SDS(步骤3)中。使用下列步骤来解决这一问题:

  • 在2-8℃下,更换3次0.1% SDS,每次透析苯酚-乙醇上清液。
  • 在2-8℃下以10,000 × g离心透析液10分钟。
  • 澄清的上清液含有适用于Western Blotting的蛋白质。

2.弃去上清液,并在0.3M盐酸胍 / 95%乙醇溶液中洗涤沉淀团3次,每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent用2ml洗涤溶液。在每次洗涤期间,室温下将样品在洗涤溶液中储存20分钟。在2-8℃下以7,500 × g离心5分钟。洗涤3次后,加入2ml 100%乙醇,并涡旋蛋白质沉淀。在室温下静置20分钟。在2-8℃下以7,500 × g离心5分钟。

注意:悬浮在0.3 M盐酸胍 / 95%乙醇溶液或100%乙醇中的蛋白质样品可在2-8°C下储存1个月或在-20°C下储存1年。

3.在真空下干燥蛋白质沉淀5-10分钟。将沉淀团溶解在1% SDS中,将微量移液管吸头置于溶液中,移动柱塞帮助溶解。在2-8℃下以10,000 × g离心10分钟,以除去任何不溶物质。将上清液转移到新管中。蛋白质溶液应立即用于Western blotting或储存在-20°C下。

故障排除指南

1.RNA分离:

A. 低产率可能是由于:

  • 样品未完全均质化或裂解。
  • 最终的RNA沉淀可能尚未完全溶解。

B. 如果A260 / A280比率<1.65:

  • 用于均质化的样品量可能太小。
  • 均质化后,可能未让样品在室温下静置5分钟。
  • 水相可能有酚相污染。
  • 最终的RNA沉淀可能尚未完全溶解。

C. 如果RNA降解:

  • 从动物身上取下组织后,可能没有立即处理或冷冻组织。
  • 用于分离的样品或者已分离的RNA制备液可能被储存于-20°C下,而不是操作程序规定的-70°C下。
  • 细胞可能已被胰蛋白酶消化而散开。
  • 用于操作的水溶液或试管可能含有RNAse。
  • 用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛的pH值可能<3.5。

D. 如果有DNA污染:

  • 用于样品均质化的试剂量可能太小。
  • 用于分离的样品可能含有有机溶剂(乙醇、DMSO)、强缓冲液或碱性溶液。

2.DNA分离:

A. 低产率可能是由于:

  • 样品未完全均质化或裂解。
  • 最终的DNA沉淀可能尚未完全溶解。

B. 如果A260 / A280比率<1.70:

  • 苯酚可能未从DNA制剂中充分除去。用0.1M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液再洗一次DNA沉淀。

C. 如果DNA降解:

  • 从动物身上取下组织后,可能没有立即处理或冷冻组织。
  • 用于分离的样品可能被储存于-20°C下,而不是操作程序规定的-70°C下。
  • 样品可能是用Polytron或其他高速均质器均质化的。

D. 如果有RNA污染:

  • 在有机相和中间相中可能存在过多水相。
  • DNA沉淀可能未用0.1 M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液充分洗涤。

3.蛋白质分离:

A. 低产率可能是由于:

  • 样品未完全均质化或裂解。
  • 最终的蛋白质沉淀可能尚未完全溶解。

B. 如果蛋白质降解:

  • 从动物身上取下组织后,可能没有立即处理或冷冻组织。

C. 如果PAGE显示条带变形:

  • 蛋白质沉淀可能未经充分洗涤。

附录

I. I.Poly A+ RNA的分离RNA
用2-丙醇沉淀RNA后(RNA分离,步骤1),将沉淀溶解在聚A 结合缓冲液中,然后通过寡核苷酸dT纤维素柱,根据Aviv和Leder操作程序选择性地去除mRNA。3

II.分离的RNA用于RT-PCR

1.1. 修改操作程序,即在初始样品制备步骤1B中进行额外的离心。注释c进一步减小了TRI Reagent LS提取的RNA中DNA污染的可能性。

2.当RNA样品用于RT-PCR时,需要更完全地蒸发乙醇。这对于小体积样品(5-20​​μl)尤其重要,如果没有充分干燥,可能含有相对较多的乙醇。

材料
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参考文献

1.
Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.
2.
Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156-159. http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2
3.
Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408-1412. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408
4.
Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163-164. http://dx.doi.org/10.1006/abio.1995.1126