采用单克隆抗体亲和凝胶进行的FLAG融合蛋白免疫沉淀

免疫沉淀(IP)可用于高效、高产量分离和纯化与FLAG®肽标签融合的蛋白质。此过程采用ANTI-FLAG® M2亲和凝胶进行,后者是一种与琼脂糖树脂共价结合的高度特异性单克隆抗体。亲和树脂可有效结合FLAG®标记蛋白,无需进行预先处理步骤和校准。免疫沉淀的FLAG®标记融合蛋白可以在酸性条件下或通过与FLAG®肽竞争,从树脂上有效地洗脱下来。随后可以分析免疫沉淀的蛋白质的大小、翻译后修饰以及电泳过程中的凝胶相互作用,同时可进行活性分析。

什么是FLAG肽标签?如何将其用于蛋白质分离和纯化?

FLAG®肽是用于蛋白质检测和纯化的标记肽。FLAG®标签肽由八个具有最大免疫原性的氨基酸(DYKDDDDK)组成,因此可产生靶向FLAG®序列的高亲和力单克隆抗体,可用于检测和分离含有FLAG®肽的蛋白质。使用重组技术,可以在蛋白质N端、C端,或蛋氨酸残基N端(Met-FLAG®)和内部位置加上FLAG®标记肽。

免疫沉淀技术概述

免疫沉淀包括以下步骤和中间体:细胞裂解、特异性抗原与抗体的结合、抗体-抗原复合物、沉淀、沉淀洗涤以及从免疫复合物中洗脱抗原。

分子pull down技术

采用M2亲和凝胶进行的FLAG融合蛋白免疫沉淀(IP)实验方案,其中的M2亲和凝胶含有与交联的4%琼脂糖珠共价结合的M2单克隆抗体

使用EZ view红色 Anti-FLAG M2 亲和凝胶(货号:F2426)或Anti-FLAG M2亲和凝胶(货号:A2220)。

少量FLAG融合蛋白纯化

注意:推荐针对免疫沉淀步骤采用两种对照反应

  • 阳性对照(FLAG-BAP融合蛋白,如氨基末端(货号:P7582)、羧基末端(货号:P7457)或Met-FLAG-BAP融合蛋白(货号:P5975)
  • 阴性对照(无蛋白的空白试剂)

a) 小心混合亲和凝胶珠,直至完全悬浮。立即使用宽孔移液器吸头(或从常规移液器吸头的末端切1 mm)将40 µL 0%浆液(20 µL填充凝胶体积)等分到1.5 mL离心管中。

b) 洗涤/平衡珠子:加入500 µL TBS(50 mM Tris HCL,150 mM NaCl,pH 7.4),涡旋并5,000-8,200 x g离心30 – 60秒。除去上清液,注意不要干扰小珠。

c) 再次如上所述洗涤,然后将试管放在冰上直至临加样。注意:当同时处理多份免疫沉淀样品时,洗涤所需的树脂总量。每次洗涤应使用TBS进行,体积至少应为填充凝胶总体积的20倍。洗涤后,可等分树脂以获得所需数量的样品。

d) 样品制备

  • 通过离心(14,000 x g,2–4°C下持续10–15分钟)澄清细胞裂解液
  • 计算所需的裂解液量。具体体积取决于转染细胞中FLAG融合蛋白的表达水平。

e) 结合:加入200–1000 µL细胞裂解物(如果需要,可加入裂解缓冲液[50 mM Tris HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100]至终体积1 mL)。注意:裂解物体积取决于转染细胞中FLAG融合蛋白的表达水平。对于阳性对照,加入1 mL TBS和4 µL 50 ng/µL FLAG-BAP融合蛋白(约200 ng)。对于阴性对照,仅添加1 mL裂解缓冲液。在2-8°C下,使用水平或直立摇床振荡孵育约1-2小时(结合步骤可延长过夜,以确保尽可能高的结合效率)。

f) 将离心管 5,000- 8,200 x g 离心30秒至1分钟,吸出上清液(流通液)。如果需要,可以保留流通液。

g) 洗涤磁珠:加入500 µL TBS,涡旋并5,000-8,200 x g离心30秒至1分钟。去除上清液

h) 再洗两遍。

i) 洗脱样品:可选择三种洗脱方法,具体选择取决于标记蛋白质的特性以及下游应用。

  1. 在天然条件下,可通过使用3X FLAG肽(货号:F4799)竞争来洗脱FLAG融合蛋白。这种洗脱方法最有效。
  2. 可在酸性条件下使用0.1 M甘氨酸HCl(pH 3.5)进行洗脱。这种洗脱方法快速有效,但需要立即中和样品。
  3. 可通过使用SDS-PAGE样品缓冲液进行电泳来实现洗脱。如果使用此方法,则磁珠不能再次使用,因为SDS会使M2抗体变性。

用3X FLAG肽(F4799)洗脱

i. 3X FLAG肽制备:

  • 将3X FLAG肽溶解在含 0.5 M Tris HCL、1 M NaCl 的 pH 7.5 溶液中 ,终浓度为25 µg / µL
  • 用diH20将储备溶液稀释5倍至终浓度5 µg / µL
  • 将3 µL 5 µg / µL储备液添加到100 µL TBS中,制备150 ng / µL浓度的洗脱工作溶液。

ii.向每份样品中加入100μL3X FLAG洗脱工作溶液,并在2–8°C轻轻摇动孵育30分钟。

iii.5,000-8,200 x g离心30秒至1分钟。将上清液转移到新管中。注意不要转移任何树脂。

1.在酸性条件下洗脱(0.1 M甘氨酸HCl pH -3.5)在室温下进行。

i. 向每份样品中添加100 µL 0.1 M甘氨酸HCl,pH 3.5
ii.轻轻摇动孵育5–10分钟
iii.5,000-8200 x g 离心树脂30秒至1分钟
iv.将上清液转移到装有10 µL 0.5 M Tris HCl、1.5 M NaCl,pH 7.4的新试管中,中和样品
v. 立即使用或-20°C长期保存。

2.用SDS-PAGE样品缓冲液(62.5mM Tris HCl,pH 6.8和2%SDS,10% (v/v)甘油和0.002%溴酚蓝)洗脱。在室温下进行。

注意:为最大限度避免抗体变性,不可加入还原剂(DTT或2-巯基乙醇)。加入还原剂会使固定的M2抗体重链和轻链解离(25-50kDa条带)

i. 向每份样品中添加20 µL 2X 样品缓冲液
ii.煮沸样品3 min
iii.5,000-8200 x g离心30秒至1分钟
iv.将上清液转移至新试管中。样品可直接上样至SDS-PAGE。

 

免疫沉淀汇总

图 1.批量免疫沉淀低丰度蛋白的选项汇总

材料
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