缓冲液:50 mM磷酸钠,150 mM氯化钠,pH 7.2或选择用来在下一步骤前存储或溶解样品的缓冲液。

使用150 mM氯化钠或具有相同离子强度的缓冲液,以避免pH依赖性非离子与基质的相互作用。在非常低的离子强度下,少数带负电荷基团的存在会导致碱性蛋白质的阻滞和酸性蛋白质的排斥。

该过程需确保样品应完全溶解。离心或过滤以去除颗粒物(附录3)。始终使用脱气缓冲液并在运行期间保持恒定温度,以避免将空气引入层析柱(表1.3)

在层析系统上设置适当的压力限制,以避免损坏层析柱填料。对高粘度溶液和低温使用较低的流速


首次使用或长期储存后

  1. 用至少0.5倍柱体积的蒸馏水以15 cm/h平衡柱(16/60柱为0.5 mL/min或26/60柱为1.3 mL/min)。
  2. 用至少2倍柱体积的缓冲液以30 cm/h进行平衡(16/60柱为1.0 mL/min或26/60柱为2.6 mL/min)。
  3. 将流速降低至15 cm/h,并采用相当于柱体积的1%的样品体积以获得最佳分辨率(对于16/60色谱柱为1.2 mL,对于26/60色谱柱为3.2 mL)。可采用0.5%和4%之间的样品体积。
  4. 用1倍柱体积的缓冲液洗脱。
  5. 在进样新样品前,用1倍柱体积的缓冲液以30 cm/h重新平衡柱,直到A280监测的基线平稳。

应通过确定每米理论塔板数和峰对称性,定期检查层析柱性能。预装色谱柱提供了建议值。有关如何检查层析柱效率,请参见附录1。

暴露在4 °C至40 °C范围之外的温度会对填充床的效率产生负面影响,并且层析柱可能需要重新灌柱。

清洁

  1. 用0.5倍柱体积的0.2 M氢氧化钠以15 cm/h的流速(对于16/60柱为0.5 mL/min或对于26/60柱为1.3 mL/min)进行洗涤,以除去大多数非特异性吸附的蛋白质。
  2. 用至少2倍柱体积的缓冲液立即重新平衡层析柱,或直至 A280监测基线和洗脱液的pH值保持稳定。

如果缓冲液含有表面活性剂,则可能需要进一步的平衡。

建议每10至20次分离后进行常规清洗,但清洗频率还取决于所用样品的性质。

如果需要,可以在121 °C、pH 7的条件下将Sephacryl HR重复高压灭菌30分钟,这不会显著影响其色谱性能。介质必须被取出因为高压灭菌会损害柱成分。注意HiPrep柱不能被重新填充。

去除严重污染

颠倒流向并在室温下使用以下溶液以10 cm/h的流速(对于16/60色谱柱为0.3 mL/min或对于26/60色谱柱为0.8 mL/min)进行洗涤:

  1. 用0.25倍柱体积的0.5 M 氢氧化钠(以除去疏水性蛋白质或脂蛋白)以及随后4倍柱体积的蒸馏水进行洗涤。
  2. 用0.5倍柱体积的30%异丙醇洗涤以除去脂质和非常疏水的蛋白质,然后用2倍柱体积的蒸馏水洗涤。

对于极端的污染情况,请查看产品随附的说明。

仅在存在严重污染时才考虑用填充有Sephacryl®介质的色谱柱进行流向颠倒。流向颠倒可能会导致在填充床上产生沟壑,导致分离度降低、效率降低以及需要重新填充色谱柱。经专业填充的色谱柱更不易受影响,但也要格外小心。

材料
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