WB检测样本前处理:细胞裂解和蛋白提取

从细胞或组织(新鲜或冷冻)中提取蛋白质的所有步骤必须在2-8°C下进行。以下是用于制备蛋白质样品的一种常见裂解缓冲液的成分。

用于蛋白质提取的RIPA缓冲液即用型溶液(货号:R0278)

  • NaCl (货号:S3014) 150mM
  • Triton X-100 (货号:T8787) 1%
  • 脱氧胆酸钠(货号:D6750) 0.5%
  • SDS (货号:74255) 0.1%
  • Tris-HCl (货号:T1503) pH 8.0, 50 mM

蛋白质提取实验方案步骤

  • 将含有细胞的培养皿中的培养基丢弃,用冰冷的PBS洗涤细胞。
  • 丢弃PBS,加入冰冷的裂解缓冲液。
  • 使用冷塑料细胞刮刀刮擦细胞。收集微量离心管中的细胞。
  • 将微量离心管中的内容物在4℃下搅拌30分钟。
  • 将离心管在4℃下以16,000G离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

从细胞悬液提取蛋白质

  • 将细胞悬液在4℃下以2,000G离心5-7分钟。细胞将聚集于试管底部,弃去上清液。
  • 向细胞沉淀中加入冰冷的PBS,并在4℃下以2,000G离心5-7分钟洗涤细胞。
  • 向细胞沉淀中加入冰冷的裂解缓冲液。将微量离心管中的内容物在4℃下搅拌30分钟。
  • 将离心管在4℃下以16,000G离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

从组织中提取蛋白质

  • 在冰上切割要研究的组织。将组织转移到圆底离心管,浸入液氮快速冷冻。
  • 对于5 mg组织,加入300 μL冰冷的裂解缓冲液,使用电动匀浆器均化。在均质化过程中另再添加300-600 μL裂解缓冲液。
  • 在4℃下搅拌内容物2小时。
  • 将离心管在4℃下以16,000G离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

标准化样品总蛋白质浓度

  • 取少量裂解物进行蛋白质估算测定。
  • 蛋白质估算可以使用考马斯蛋白质测定试剂(货号:27813)、BCA 测定、280nm吸光度、或用于总蛋白定量的DirectDetect® 红外光谱仪进行。
  • 通过与标准样品比较确定未知样品的蛋白质浓度,确保将标准样品稀释到与未知样品相同的缓冲液中。
  • 将适当体积的裂解物转移到微量离心管中,使得所有样品都含有相同的总蛋白质浓度。
  • 加入足够的冰冷裂解缓冲液,使所有裂解物具有相同的体积。

将样品与Laemmli上样缓冲液混合

以下是制备电泳样品所需的上样缓冲液的成分。

2X Laemmli上样缓冲液
溴苯酚蓝(货号:B5525)0.004% 0.004%
2-巯基乙醇 10%
甘油(货号:G5516)20%
SDS(货号:74255)4%
Tris-HCl(货号:T1503)0.125 M

  • 向一定量的细胞裂解物中加入等量的上样缓冲液。
  • 将上述混合物在95℃下煮沸5分钟。以16,000G离心5分钟。
  • 这些样品可以在-20°C下储存,也可以用于进行凝胶电泳。