Western Blotting实验方法(免疫印迹实验方法)

Western Blotting指的是将蛋白从十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶向PVDF膜或硝化纤维素膜上的电泳转移,以及随后使用带有荧光或化学发光检测抗体而对蛋白进行的免疫检测。

Western Blotting工作流程步骤

  1. 样品制备:细胞裂解和蛋白质提取
  2. SDS-PAGE凝胶电泳
  3. 膜转印
    a) 槽式湿转
    b) 半干转
  4. 免疫检测
    a) 传统摇床孵育抗体检测
    b) 使用SNAP i.d.®系统的30分钟免疫检测实验方法
    c) 利用Immobilon GO的无人值守式免疫检测
  5. 疑难排查指南

膜转印(槽式湿转)实验方法

材料

  • 印迹纸
  • 转印膜(例如,Immobilon® PVDF膜)
  • 转印缓冲液
  • 甲醇、乙醇或异丙醇
  • 槽式湿转系统(例如,SB10 omniPAGE微型电泳系统)
  • 电源

设置

  1. 制备足够的转印缓冲液,用于填充转印槽外加200 mL用于平衡凝胶和膜以及湿润滤纸。
  2. 将凝胶从其盒中取出;裁去堆积胶和胶孔。
  3. 将凝胶浸没在转印缓冲液中10至30分钟。
  4. 将滤纸浸泡在转印缓冲液中至少30秒。
  5. 制备膜:

    a. 如果使用PVDF膜,将膜在甲醇中浸湿15秒。膜应当是均一的
    从不透明变为半透明。
    b. 将膜小心置于Milli-Q®水中并浸泡2分钟。
    c. 将膜小心置于转印缓冲液中并让其平衡至少5分钟。

转印膜组组装

  1. 打开盒支架。

    重要:为确保均匀的转移,可使用印迹滚轮去除层与层之间的气泡,或在膜组中每一层表面上小心地滚动移液器或搅拌棒。不要施加过度的压力以防止损伤膜和凝胶。

  2. 将一块泡沫(纤维)垫放置在盒的一侧。
  3. 将一片滤纸放置在垫子的上面。
  4. 将凝胶放置在滤纸的上面。
  5. 将膜放置在凝胶的上面。
  6. 将第二片滤纸放置在膜组的上面。
  7. 将第二片泡沫垫放置在滤纸的上面。
  8. 盖上盒支架。

用于蛋白转印(槽式湿转)的方法

  1. 将盒支架放置在转印槽中,使得盒支架的一侧面向阴极(-)而膜的一侧面向阳极(+)。
  2. 向槽中加入足量的缓冲液以浸没盒支架。
  3. 将黑色阴极导线(–)插入阴极插孔,红色阳极导线(+)插入到转印单元上的阳极插孔。
  4. 将阳极导线和阴极导线与其相应的电源相连。
  5. 如果可以,可按照操作说明在槽式湿转单元上设置冷却单元。
  6. 以6至8 V/cm的电极间距离打开系统1至2个小时。遵循转印槽的操作指南以获得优化的详细信息。
  7. 转印完成后,将盒支架从槽中取出。
  8. 用镊子小型的将转印膜组拆卸。

成功进行Western Blotting转印的小窍门

  • 两种类型的转印系统(槽式湿转和半干转)中,应格外小心以防止在滤纸、凝胶或膜之间的任何地方引入气泡。
  • 用恒定电流进行蛋白转印。如果是以恒定电压进行转印,请对电流保持监测以确保其不超过0.4安培。从100 V开始,并在电流过高时降低电压
  • 更厚的凝胶或更大的蛋白可能需要更长的转印时间或增强的场强度。实际的转印条件应针对每套系统进行优化。
  • Immobilon®转印膜的两面都可以同样很好的被使用。两侧的外观(发亮或暗淡)不会影响膜的转移和检测效率。
  • 对于含有小肽的样品,应将凝胶在转印缓冲液中的平衡时间限制在10分钟内。
  • 当目标蛋白小于或等于20 kDa时,可使用Immobilon® PSQ获得最大的保留。
  • 可使用Immobilon®-FL转印膜用于荧光检测方法。
  • 凝胶可被单独转印或在单一膜组中转印多块凝胶。

半干转膜转印实验方法

材料

  • 印迹纸
  • 转印膜(例如,Immobilon® PVDF膜)
  • 阳极缓冲液I:0.3 M Tris,pH 10.4,10% (v/v)甲醇。
  • 阳极缓冲液II:25 mM Tris,pH 10.4,10% (v/v)甲醇。
  • 阴极缓冲液:25 mM Tris,40 mM 6-氨基-正己酸(甘氨酸可被取代),10% (v/v)甲醇,pH 9.4。
  • 半干转仪(例如,产品货号B2529)
  • 电源

设置

  1. 制备阳性缓冲液各200 mL以及400 mL的阴极缓冲液。
  2. 将凝胶从其盒中取出;裁去堆积胶。
  3. 将凝胶浸没在阴极缓冲液中15分钟。
  4. 将两片滤纸浸泡在阳极缓冲液I中至少30秒。
  5. 将一片滤纸浸泡在阳极缓冲液II中至少30秒。
  6. 将三片滤纸浸泡在阴极缓冲液I中至少30秒。
  7. 制备膜:
    a. 将膜在甲醇中浸湿15秒。膜应当是均一的从不透明变为半透明。
    b. 将膜小心置于Milli-Q®水中并浸泡2分钟。
    c. 将膜小心置于阳极缓冲液II中并让其平衡至少5分钟。

对于单一的转印:

  1. 将阳极电极板置于水平桌面上。
  2. 将浸泡在阳极缓冲液I中的两片滤纸放置在板的中间。
  3. 将浸泡在阳极缓冲液II中的滤纸放置在前面两片滤纸的上面。
  4. 将膜放置在这些滤纸的上面。
  5. 将凝胶放置在膜的上面。
  6. 将浸泡在阴极缓冲液中的三片滤纸放置在膜的上面。
  7. 将阴极电极板置于膜组的上面。

对于多重转印:

  1. 将阳极电极板置于水平桌面上。
  2. 将浸泡在阳极缓冲液I中的两片滤纸放置在板的中间。
  3. 将浸泡在阳极缓冲液II中的滤纸放置在前面两片滤纸的上面。
  4. 将膜放置在这些滤纸的上面。
  5. 将凝胶放置在膜的上面。
    对于最后一块凝胶,回到第10步开始。
  6. 将浸泡在阴极缓冲液中的一片滤纸放置在凝胶的上面。
  7. 将一片透析膜放置在这些滤纸的上面。
  8. 将浸泡在阳极缓冲液II中的一片滤纸放置在透析膜的上面。
  9. 重复第4至8步直至所有的凝胶(最高至单元的上限)都已被插入到膜组中。
  10. 将浸泡在阴极缓冲液中的一片滤纸放置在最后一块凝胶的上面。
  11. 将阴极电极板置于膜组的上面。

    重要:在转印期间,请勿撞击阴极板盖,因为这可能会干扰转印膜组的对齐并导致结果的不准确。

用于蛋白转印(半干转)的方法

  1. 将黑色阴极导线(–)插入阴极板插孔。
  2. 将红色色阴极导线(+)插入阳极板插孔。
  3. 将阳极导线和阴极导线与其相应的电源输出相连。
  4. 打开电源。
  5. 设置电流并按照下表所示设置转印时间:
表1.蛋白半干转的建议时间

*表面积(cm2)是根据阳极板上的膜组足迹尺寸计算得出的。该值与膜组中的凝胶数量无关。

传统的免疫检测

材料

  • 一抗和二抗
  • Orbital摇床*(产品货号Z768499)
  • 2-3 mm深的托盘,略微大于印迹膜的尺寸
  • 检测底物(用于过氧化物酶或磷酸酶抗体偶联物)
    - 化学发光底物
    - 生色底物

*摇床和托盘仅在传统的免疫检测中需要;对于使用
SNAP i.d.®系统进行的快速、真空驱动免疫检测,可参考SNAP i.d.®免疫检测实验方法。

抗体孵育

  1. 将印迹膜置于封闭液中,摇晃孵育1小时。
  2. 将印迹膜置于一抗溶液,如抗-β-Actin单克隆抗体中摇晃孵育1小时。溶液应当可在膜的表面自由移动。
  3. 将印迹膜置于PBS并洗涤10分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
  4. 将印迹膜置于二抗溶液中,在室温或37 °C摇晃孵育1小时。
  5. 将印迹膜置于PBS并洗涤10分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
  6. 进行生色、化学发光或免疫检测。还可查看用于蛋白检测的相关资源:
    蛋白质的生色和化学发光检测
    使用BCIP/NBT底物进行免疫检测

化学发光检测

按照操作说明。

  1. 按照操作说明进行底物制备。
  2. 将印迹膜置于一容器中,加入底物至完全覆盖住膜。
    孵育1分钟。
  3. 吸干多余的底物。
  4. 将印迹膜置于一块洁净的玻璃上并用用保鲜膜包裹。
    注意:还可使用纸张裁剪保护器或冷冻袋。
  5. 缓慢排除任何的气泡。
  6. 在暗室中,将包裹的膜置于胶片盒中。
  7. 在上面放置一片放射自显影胶片并盖上胶片盒。
  8. 曝光胶片。应进行多次15秒至30分钟的曝光以确定最佳的曝光时间。1至5分钟是比较常见的。

荧光检测

所需设备

  • 转印到Immobilon®-FL转印膜上的蛋白并用抗体进行结合。
  • Mylar®盖膜。
  • 荧光成像设备。

以下是进行荧光免疫检测的常规实验方法。为了获取最佳的结果,可参考试剂所附带的实验方法。

注意:如果使用化学荧光试剂,请遵循试剂厂商的指导。

  1. 将印迹膜置于稀释后的荧光标记二抗溶液中,缓慢摇晃孵育1小时。
  2. 用洗涤缓冲液洗涤印迹膜3-5次,每次5分钟。
  3. 将印迹膜置于一块洁净的滤纸上用于干燥。
  4. 如果使用盖膜,请用Mylar®。不要使用Saran™盖膜,因其会透光并让荧光发生淬灭。
  5. 使用适当的荧光扫描仪对印迹膜进行成像。
表2.Western Blotting故障排除指南