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衍生化试剂液相色谱应用

Jay Jones, Katherine Stenerson

Reporter US Edition 25.1

简介

与HPLC等其他技术相比,液相色谱分析的分析物范围会有些限制。造成这种情况的两个原因可归因于化合物挥发度较低或没有,或是热稳定性较差。克服这些问题的方法是利用衍生化处理将分析物修饰成更“易于液相色谱”的形式。

BSTFA+TMCS作为GC衍生化试剂

衍生化技术涉及特殊的衍生化试剂与目标分析物的反应。根据分析物特征和功能性可选用各种试剂。GC分析较常用的反应之一是将三甲基硅烷(TMS)官能团引入化合物。此过程又称为三甲基硅烷化。N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(又名BSTFA)常用于这种反应。

各种官能团对给定硅烷化试剂的易衍生化度按此排序:醇>苯>羧酸>胺>酰胺。在此序列内,对特定硅烷化试剂的反应性还会受空间位阻影响。因此,对醇类的易反应性按此排序:一级>二级>三级,胺类排序:一级>二级。

对中等受阻或反应慢的化合物,可添加催化剂到BSTFA中。一些较常用的催化剂是三甲基氯硅烷(也叫TMCS)、三氟乙酸、盐酸、乙酸钾、哌啶、O-甲基羟胺盐酸盐和吡啶。

衍生化过程考虑因素

进行衍生化反应时必须注意一些参数。比如,醇在室温下可能只几分钟就完全衍生化。但是,酰胺或空间位阻的羧酸在提高的温度中可能需要几小时完成反应。

除时间和温度外,试剂浓度也很重要。建议加入过量硅烷化试剂。一般情况下,至少添加2:1摩尔比的BSTFA对活性氢。

大多数衍生化试剂对水敏感。水的存在会减慢或完全终止反应。湿气也会分解TMS试剂或形成的衍生物。因此建议将衍生化试剂储存于含有干燥剂的第二层容器中。另外,待衍生化萃取物应该除去湿气。

衍生化示例

不做衍生化时,雌激素类化合物和麦角酸二乙酰胺(LSD)进行GC分析的响应很弱或无响应。引入TMS基团后,这些分析物显示极好的峰形和响应。下节详述了控制了上述过程考虑因素的步骤,确保衍生化反应完全。

四种雌激素类化合物中,三种在75°C下30分钟内完全衍生化。但是,雌三醇的活性氢中30分钟内只有两个被烷基化(根据GC-MS获得的光谱数据)。萃取物在75°C下进行第二次衍生化,反应时间增加到45分钟。室温放置过夜后,GC-MS分析确认了全部三个活性氢原子都已被TMS基团替代。图1展示了最终的色谱图。

雌激素类化合物液相色谱分析

图 1.雌激素类化合物液相色谱分析

麦角酸二乙酰胺(LSD)在与雌激素类化合物相似的条件下进行衍生化,但温度为68°C。反应每隔30分钟取样。在这个温度,这一反应即使超过5小时也从未超出60%的完成度。然后将温度调高到75 °C。升高的温度推动反应到达近95%的完成度。液相色谱分析即使近3小时后仍能检测到LSD和LSD(TMS)峰形,意味反应没有达到100%完成度。色谱图见图2

LSD-TMS液相色谱分析

图 2.LSD-TMS液相色谱分析

结论

衍生化反应使广泛的分析物能进行液相色谱分析。但是少数反应参数可能需要试错优化。示例中,温度和时间对使反应接近完全都很重要。这两个实例说明每个衍生化反应必须优化达到高比例完成度,才能得到良好的峰形和检测器响应。

参考文献

1.
Knapp DR. 1979. Handbook of Analytical Derivatization Reactions, John Wiley & Sons, New York..