抗生素杀灭曲线

• 何为抗生素杀灭曲线？
• 建议的杀灭曲线抗生素浓度
• 杀灭曲线实验方案
• 谨记以下要点

何为抗生素杀灭曲线？

抗生素杀灭曲线是一项剂量响应实验，通过逐渐增大施加在哺乳动物细胞中的备选抗生素剂量，测定特定时间内杀死所有细胞的最低抗生素浓度。这是使用备选抗生素杀死未转染细胞、形成稳定细胞系之前的关键步骤。由于每种哺乳动物细胞系对抗生素的敏感程度不一，因此始终建议针对不同细胞系和抗生素单独进行杀灭曲线实验。

建议的杀灭曲线抗生素浓度

下表列出了此剂量响应实验可能采用的常用备选抗生素浓度范围。

剂量响应可能因待测细胞系而异。此处的浓度范围仅供参考；初次使用备选抗生素或将其用于新细胞系时，必须单独进行杀灭曲线实验。

表1 推荐的备选抗生素浓度

备选抗生素	货号	浓度范围
放线菌素D	A9415	5 – 10 µg/mL
硫酸博来霉素	B8416	10 – 50 µg/mL
羧苄青霉素	C3416	100 – 1000 µg/mL
氯霉素	C3175 C1919	5 – 50 µg/mL
G 418二硫酸盐	A1720 G1279	100 – 800 µg/mL
G 418二硫酸盐溶液	G8168	100 – 800 µg/mL
硫酸庆大霉素	G1264	50 – 1000 µg/mL
庆大霉素溶液	G1272 G1397 G1522	50 – 1000 µg/mL
潮霉素B	H3274 H9773	200 – 800 µg/mL
硫酸卡那霉素	K1377	100 – 1000 µg/mL
卡那霉素溶液	K0254 K0129	100 – 1000 µg/mL
丝裂霉素 C	M4287 M7949 M5353	10 – 100 µg/mL
霉酚酸	M3536	25 µg/mL
新霉素三硫酸盐	N6386 N3144	10 – 100 µg/mL
新霉素溶液	N1142	10 – 100 µg/mL
硫酸诺尔斯菌素	N0186	75 – 100 µg/mL
硫酸巴龙霉素	P8692 P5057	100 – 1000 µg/mL
嘌呤霉素	P8833	10 – 100 µg/mL
嘌呤霉素溶液	P9620	10 – 100 µg/mL
利福平	R7382	10 – 50 µg/mL

杀灭曲线实验方案

以下实验方案概述了绘制细胞杀灭曲线的步骤。

准备物品：

• 健康状态的目标细胞系
• 您的细胞系建议的完全培养基（培养基 + 血清）
• 您感兴趣的备选抗生素

步骤：

• 通过胰蛋白酶或温和刮取，收获健康的贴壁细胞。
• 用完全培养基稀释细胞悬液，接种到 96 孔板各孔中，终体积为 100 ul。处理当天建议的细胞密度约为 50%。
• 24孔板中抗生素处理前的典型细胞密度：
• 0.8 – 2.5 X 10⁵各细胞/ml贴壁细胞
• 2.5 – 4.5 X 10⁵个细胞/ml 悬浮细胞
• 37 ^oC孵育过夜，或直至所有细胞均调整良好且健康。

注意：细胞处于活跃分裂状态时，抗生素最有效。 因此，建议采用最优细胞密度，以实现最准确的剂量响应。

图 1. 示意图 - 备选抗生素浓度。

• 用含不同浓度备选抗生素的新鲜培养基置换培养基。参照96孔板形式（图 1）所示，每个浓度维持一式三份。
• 每48小时更换含抗生素的培养基。
• 培养细胞7-10天，定期在光学显微镜下观测细胞。根据所用细胞系，培养时间可延长至14天。
• 第10天，通过MTT测定法或准确的细胞计数器测定各孔细胞活率。
• 选择完全阻止细胞生长的抗生素浓度。在所有转染实验中，基于该浓度筛选可进一步生长为稳定细胞系的耐受性转染细胞（图2）。

图 2. 模拟抗生素杀灭曲线

谨记以下要点

• 维持适当的对照或空白样：
  • 孔中仅含有培养基和抗生素，不含细胞
  • 孔中仅含有培养基和细胞，不含抗生素
• 确保培养箱处于完美工作状态，避免因培养基蒸发导致抗生素浓度增大，从而导致读数错误

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