蓝白斑筛选和菌落筛选实验方案

重组细菌鉴定

蓝白斑筛选是一种快速有效的重组细菌鉴定技术,依赖于β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶是一种在大肠杆菌中出现的酶,将乳糖切割成葡萄糖和半乳糖。

破坏LacZ 基因

周围环境中乳糖的存在触发了大肠杆菌中的lacZ操纵子。操纵子的活性导致产生代谢乳糖的β-半乳糖苷酶。大多数质粒载体携带lacZ基因的短片段,其含有β-半乳糖苷酶的前146个氨基酸的编码信息。使用的宿主大肠杆菌菌株是含有lacZΔM15缺失突变的感受态细胞。当质粒载体被这种细胞吸收时,由于α-互补过程,产生了功能性β-半乳糖苷酶。

这种α-互补过程作为重组的标记,以此操纵克隆中所使用的质粒载体。多克隆位点(MCS)存在于质粒载体的lacZ序列内。该序列可以被限制酶切口以插入外源DNA。当含有外源DNA的质粒载体被宿主大肠杆菌摄取时,不会发生α-互补,因此不会产生功能性β-半乳糖苷酶。如果外源DNA未插入载体,或者如果插入MCS以外的位置,则质粒载体中的lacZ基因补充宿主大肠杆菌中的lacZ缺失突变,产生功能性酶。

蓝白斑筛选的原理

为了筛选含有重组DNA的克隆,将X-gal生色底物加入到琼脂板中。如果产生β-半乳糖苷酶,则X-gal水解形成5-溴-4-氯-吲哚氧基,其自发二聚化而产生称为5,5'-二溴-4,4'-二氯-靛蓝的不溶性蓝色色素。由非重组细胞形成的菌落因此呈现蓝色,而重组细胞的菌落呈现白色。从而可以容易地挑选和培养所需的重组菌落。

异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)与X-gal一起用于蓝白斑筛选。IPTG是一种不可代谢的半乳糖类似物,可诱导lacZ基因的表达。应该注意的是,IPTG不是β-半乳糖苷酶的底物,而只是诱导物。为了视觉筛选目的,需要像X-gal那样的生色底物。

可用于蓝白斑筛选的典型质粒载体的示意图。

图 1.可用于蓝白斑筛选的典型质粒载体的示意图。

典型的蓝白斑筛选程序的示意图。

图 2.典型的蓝白斑筛选程序的示意图。

蓝白斑筛选产品(材料)

蓝白斑筛选的实验方案

蓝白斑筛选的完整实验方案包括3个重要步骤:

  • 连接:将外源DNA连接到质粒载体的MCS中
  • 转化:将含有外源DNA插入物的质粒载体转化到感受态大肠杆菌
  • 筛选:蓝白斑筛选,以鉴定重组细菌菌落

连接

Sigma-Aldrich提供以下即用型表达载体,可用于稳定和瞬时表达系统。这些FLAG-融合构建体具有在细菌和哺乳动物细胞中繁殖的复制起点。

所需材料

以下是连接的反应条件

  • 将上述所有组分加入到干净的反应管中。
  • 在25°C下孵育30分钟(可在热循环仪中进行)。
  • 使用PCR纯化柱纯化DNA,并以约50 μL洗脱。
  • 将0.1-10 ng的连接产物转化为与载体相容的化学或电感受态细胞。

转化

高质量的质粒对转化过程至关重要。以下是Sigma-Aldrich提供的用于分离和纯化适合转化的高质量质粒的试剂盒。

关于化学或电感受态细胞转化的详细实验方案,请参见此处。

筛选

Sigma-Aldrich提供一系列有助于筛选重组细菌的生色底物。一些产品可用于在LB琼脂板上铺展(筛选实验方案1),另一些产品则可掺入微生物培养基中(筛选实验方案2)。产品在需要时与IPTG一起使用。这两个实验方案的详细步骤如下。

筛选实验方案1(适用于产品编号B6650、16658、B2904、B3928、16669、B8931

  • 使用无菌涂布器在LB琼脂板上涂布40 μL或适量的生色底物和10 μL IPTG溶液的原液(当使用产品编号B3928时不需添加IPTG,因为它已经含有IPTG)。
  • 琼脂板应包括含有适当抗生素和不含抗生素的对照。
  • 将板置于层流室中干燥,盖子略微打开。
  • 使用无菌涂布器将10-100 μL已转化的大肠杆菌细胞涂布到LB琼脂板上。
  • 将板在37°C孵育24-48小时。
  • 琼脂表面出现蓝色和白色菌落。选择白色菌落中的重组细胞进​​行培养。

筛选实验方案2(适用于产品编号S7313、S9811、C4478

  • 制备LB琼脂:称重适量粉末培养基、琼脂和水,将其添加到无菌瓶中。也可称取适量C4478,添加到有水的无菌瓶中。
  • 高温高压灭菌之前,将300 mg/L产品编号S7313和S9811以及500 mg/L柠檬酸铁铵(产品编号F5879)添加到培养基中。如果使用C4478,则省却该步骤。
  • 将培养基高温高压灭菌,并冷却至瓶子刚好不烫手的温度。
  • 向培养基中加入适当浓度的选定抗生素。
  • 将约25-30 mL的LB琼脂倒入无菌板让其凝固,期间使盖子稍微打开。
  • 使用无菌涂布器将10-100 μL已转化的大肠杆菌细胞涂布到LB琼脂板上。
  • 将板在37°C孵育24-48小时。
  • 琼脂表面出现蓝色和白色菌落。选择白色菌落中的重组细胞进​​行培养。
用X-gal对重组细菌进行蓝白斑筛选。

图 3.用X-gal对重组细菌进行蓝白斑筛选。

蓝白斑筛选的局限性

  • 蓝白斑技术只是一种筛选程序,不是一种选择技术。
  • 载体中的lacZ基因有时可能不起作用而无法产生β-半乳糖苷酶。得到的菌落不是重组的,但仍呈现白色。
  • 即使有小序列的外源DNA插入到MCS中并改变lacZ基因的读码框。这导致假阳性白色菌落。
  • lacZ的读码框内的小插入物可能产生模糊的浅蓝色菌落,因为β-半乳糖苷酶仅部分失活。

参考文献

1.
Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: 参考文献.
2.
Padmanabhan S, Banerjee S, Mandi N. Screening of Bacterial Recombinants: Strategies and Preventing False Positives. http://dx.doi.org/10.5772/22140