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pLKO-1载体和shRNA设计

MISSION® shRNA载体图谱

pLKO.1载体是否是基于HIV的载体?如果是的话,是否存在安全问题?

pLKO.1载体载体是基于慢病毒(HIV)的质粒。这种载体被认为是生物安全性2级材料,由于其改良特性(去除了大量蕴含着HIV病毒毒力的附属基因、最大限度减少病毒微粒的基因组含量,无复制能力及自灭活特性)而无法在感染宿主细胞之后产生病毒,因而可以安全使用。有关具体要求请询所属机构的生物安全专员。

MISSION®慢病毒微粒可以在实验室内进一步传播吗?

不会,慢病毒微粒不会因为安全原因传播。MISSION® TRC慢病毒微粒存在复制缺陷。这种微粒采用第2、3代慢病毒包装系统特性生产。包装的病毒基因组内不含复制和结构蛋白基因,因为这些基因是由包装细胞内的其他质粒提供的。病毒基因组仅含有pLKO的5’ 和3’ LTR之间的区域。1此外,慢病毒载体含有自灭活的3’ LTR,使其无法在侵入宿主染色体后产生感染病毒。

这种病毒系统的功能如何发挥作用?

此文库基于慢病毒,即可以通过适当的包装细胞系生产病毒微粒。采用所得慢病毒微粒感染后,shRNA序列引入到染色体,稳定表达发卡RNA。VSV-G包膜蛋白分布广泛,几乎可以递送到任何细胞。此外,慢病毒引入宿主细胞基因组不需要有丝分裂活动。

为何始终存在3' UTR区域的克隆?

包含靶标基因3' UTR的克隆,可以在引入与靶标对应的cDNA克隆时,可以回补敲低表型。相对于内源性基因,从外源性cDNA克隆的转录不易被沉默。许多论文/评论委员会要求进行此类实验确认观测到的表型。但虽然大多数基因集具有这一附加特性,但并非全部含有3' UTR克隆。

为何要选择U6启动子?

人U6启动子(pol III启动子)用于驱动shRNA发卡结构表达。使用pol III启动子表达可以精确启动和终止转录,最适合生成shRNA。由于与其他高效的pol III启动子(H1)相比,U6的实验数据展现出了更高的效率,故TRC选择了U6。

哪些包装系统与pLKO.1 shRNA载体相容?

克隆进MISSION® TRC shRNA的pLKO.1转运载体与标准2型质粒(含有rev基因的包装载体和包膜载体)或3型质粒(不含rev基因的载体,包膜载体和rev表达载体)包装系统相容。

哪些限制性位点可用来克隆shRNA序列?我之所以对此感兴趣,是因为我希望获得部分shRNA结构,但我是否需要将序列插入到不同的骨架载体?

shRNA 克隆进AgeI和EcoRI位点。在我们的网站,也可查询到单独的发卡序列。

MISSION® TRC文库是否包含可用于微阵列分析的条形码?

目前,我们的载体不含内置条形码,我们也未专门富集基因集克隆。您可以使用单独的shRNA序列筛选稳定掺入的克隆群体。

我可以在“搜索shRNA发卡序列页面”搜索和设计自己的shRNA吗?

设计MISSION® TRC克隆文库所用的算法与TRC页面基本相同。但由于是Broad-TRC克隆文库,设计会出现许多改进。您在公共TRC页面查找到的克隆并非最新设计版本。最新的TRC克隆仅可通过Sigma-Aldrich提供给TRC会员。

我希望敲低的蛋白非常稳定,在细胞分裂时,siRNA表达时间会否延长?

此文库基于慢病毒,即可以将shRNA稳定掺入到宿主染色体。稳定的克隆或群体可通过加入嘌呤霉素进行选择。可以选择单独的克隆并进行扩增。由于shRNA掺入具有随机性,同时筛查多个克隆有助于实现目标基因的最佳敲低效果,验证可能的脱靶过表达图谱。

非靶标对照载体为何不会影响哺乳动物基因表达?

非靶向对照载体(SHC002, SHC002V)含有不靶向人类和小鼠基因的shRNA插入片段,因而便于作为采用MISSION shRNA克隆文库进行实验的阴性对照。有关发卡序列和载体图谱,请查看产品列表。

pLKO.1含WPRE吗?

不含。WPRE(美洲旱獭肝炎病毒转录后调控元件)已知具有增强转基因转录的能力,但对于shRNA转录并非必需。此外,有些人认为WPRE可能会影响致癌基因活性,对体内和临床实验可能具有启示意义。