无论微生物是天然来源抑或是人工基因工程改造的成果,所有微生物学家最初的目标都是确保自己的微生物培养物能够可重现地生长。为实现这一目标,需要提供明确的环境条件,涉及能量来源、温度、pH和营养成分等要求(微生物生长要求)。我们为此提供了一系列产品和服务(请参见培养物清单、培养基比较等),确保满足一般微生物学家和专家的需求。

微生物

在归类为微生物的生物群组中,存在简单的单细胞形式(球菌、杆菌、病毒和螺旋体)以及多细胞形式(丝状体和鞘)。微生物群组包括蓝绿藻(蓝细菌)、真菌、原生动物和细菌。

为了生存和生长,微生物需要能量与营养来源。细菌是最原始的微生物形式,但由多种简单和复杂的分子组成,能够进行广泛的化学转化。根据它们的要求和使用的能量来源,它们被分为不同的营养群组。

生物体树

图 1.

从不足1μm的病毒(只能在电子显微镜中看到)至几cm大的丝状藻类或真菌,微生物的大小跨度极大,包括:

表1.

微生物生长要求

微生物生长需要适当的环境条件、能量来源和营养。这些要求可分为物理和化学两大类。

化学因子

自然界中发现的天然微生物生长必需元素与微生物培养基提供的化学形式对比表

表2.

* 亦用作缓冲剂。
1为促进铁在溶液中溶解或保留,可以向培养基中加入络合剂,例如EDTA或柠檬酸盐。

物理/环境因素

温度

大多数微生物在人类、高等植物和动物喜欢的正常温度下生长良好。然而,某些细菌却在极端温度(极热或极冷)下生长,而在这些温度下却很少有高等生物可以存活。根据其优选的温度范围,细菌分为三组。嗜冷菌(喜冷微生物),主要存在于海洋深处、冰雪中和北极地区,其最佳生长温度在0°C至15°C之间,最高生长温度不超过20℃。嗜温菌(喜欢温度适中的细菌),常见于水、土壤和高等生物中,是所研究的最常见微生物。它们的最佳生长温度范围在25°C至40°C之间。许多致病菌的最适温度是37°C,因此嗜温菌构成了我们常见的大部分腐败和疾病微生物。嗜热生物(喜热微生物),能够在高温下生长,最佳温度高于60°C。有些生物在接近水沸点的温度下生长,压力下甚至能在高于100°C的温度下生长。大多数嗜热生物在45 °C以下的温度不能生长。

pH值(酸碱度)

大多数细菌最宜在pH值6.5至7.5之间接近中性的较窄的pH范围内生长。在极端pH值下生长的生物可归类为嗜酸性生物(喜酸)或嗜碱性生物(喜碱)。嗜酸菌在pH值低于4时生长,一些细菌在pH值为1时仍然具有活性。嗜碱菌优选pH值为9-10的环境,并且大多数不能在pH等于或低于中性的溶液中生长。在细菌生长期间,通常会有有机酸被释放到培养基中,这会降低其pH并因此干扰或完全抑制进一步的生长。虽然常见的培养基成分(如蛋白胨和氨基酸)具有较小的缓冲作用,但在大多数细菌培养基中需要外部缓冲剂,以中和酸并维持正确的pH。磷酸盐在大多数细菌的生长pH范围内具有缓冲作用、无毒,且提供磷源(而磷是必需的营养元素),是最常用的缓冲剂。然而,高浓度磷酸盐的缺点是它会导致由培养基中不溶性金属磷酸盐(如铁)沉淀引起的严重营养受限。

渗透压

微生物含有大约80-90%的水,如果置于具有较高溶质浓度的溶液中,则会失去水分,导致细胞萎缩(质壁分离)。然而,一些细菌已经很好地适应了高盐浓度,实际上它们需要盐才能生长。这些细菌称为嗜盐菌(喜盐),存在于盐场或死海这样的地方。

表3.
微需氧菌

图2:

使用氧气产生能量的微生物称为嗜氧菌,如果它们需要氧气进行新陈代谢,则称为专性嗜氧菌。由于氧气在水中溶解性差,并且大部分环境缺乏这种必要元素,因此专性嗜氧菌处于生长劣势。通常,嗜氧菌保留了无氧生长的能力,这类细菌被称为兼性厌氧菌。那些不能使用氧气并且实际上会被氧伤害的细菌称为专性厌氧菌。进一步分类包括:微需氧微生物,它们是嗜氧微生物,只能容忍通常低于大气浓度的较窄范围的氧浓度,因此通常很难在实验室中培养,而且耐氧菌在氧气存在下生长但不需要氧气。

与高等生物相反,微生物的代谢取决于液态水的存在。微生物对可用水的要求差别很大。为了比较固体和溶液的可用水含量,水活性或相对湿度是有用的参数。

二氧化碳

在自养代谢中,微生物利用各种能量来源以及还原能,将CO2还原为有机化合物。如果要培养依赖CO2的自养微生物,通常将碳酸氢钠加入培养基中,并在密闭容器中在含二氧化碳的空气中进行孵育,或者让空气或富含二氧化碳的空气在容器中流通进行孵育。一些化学自养生物是嗜氧的,使用氧作为最终电子受体,并从各种无机电子供体的呼吸中获得能量,而另一些微生物则使用除氧之外的无机末端电子受体参与无氧呼吸。异养(=同化有机碳源)微生物也需要二氧化碳。生活在血液、组织或肠道中的许多细菌适应二氧化碳含量高于正常空气二氧化碳含量的环境。因此,这些细菌在含有10%(体积)二氧化碳的空气中培养。光养菌是专性厌氧菌,利用光能进行一系列将二氧化碳转化为磷酸丙糖和其他细胞成分的反应。即使二氧化碳被回收而不是被同化,但几乎所有生长细胞都绝对需要足够的pCO2。因此,需要重点注意去除二氧化碳(例如通过KOH吸收),抑制几乎所有细菌的生长。

微生物培养方法及从自然界分离

通过各种技术从其天然环境中分离微生物。如果微生物群体常见、密集或足够大,可以用无菌拭子或环直接取样,并接种到合适的液体培养基中或抿到琼脂板上。这尤其适合存在大量生物和局部化区域的医学样品。具有大量微生物群的环境样品,例如土壤,也可直接添加到合适的培养基中。如果微生物不常见,需要预富集。即过滤样品并在合适的培养基中孵育滤膜。过滤方法通常应用于液体样品(例如河水和海水)和空气采样。环境样品现场取样涉及埋藏载玻片或埋藏毛细管等技术,需要将涂有合适培养基的显微镜载玻片或毛细管埋在自然环境(土壤或沉积物)中,并且仅在特定时间后取回。然后将载玻片或毛细管加入到新鲜培养基中,并对生物进行传代培养。当生物生长缓慢且需要特殊条件时,或者需要尽可能减少环境干扰时,可采用上述方法。

可借助图示微生物培养方法对所有样品进行传代培养。

微生物培养方法

图 3.

微生物分类和鉴别

分类学是将个体分类为群体的理论和操作技术。有三组分类方法:

数值分类法

数值分类法定义为“根据分类单位的特征将分类单位分组为分类群的数值分类法”。这涉及使用一系列生化和培养测试(例如:降解的有机化合物的种类,对各种维生素或辅酶的需求,染色反应,以及用抗生素抑制生长)来研究细菌的所有生理特征。将结果在计算机上编码,个体之间的关系表示为树状图。这种形式的分类学分类没有提及细菌菌株之间的进化关系。含有许多这些试验的试剂盒现已商业化,便于鉴别几组细菌。

化学分类法

这种分类是根据假定从共同祖先遗传的一组特征来进行个体分组。在化学分类学中,根据细菌结构组分之间的化学相似性对细菌分组。最常用的材料是蛋白质,它们是在进化过程中保存完好的分子。为了建立共同的族谱,化学分类学家通常分析酶、肽聚糖、细胞质膜及其脂肪酸组分、外膜和代谢最终产物的主要结构。

分子分类法

这种分类是比较染色体DNA或核糖体RNA的基因序列,以建立相似性模式和群组的系统发育演变。尽管嘌呤(G,鸟嘌呤;A,腺嘌呤)和嘧啶(C,胞嘧啶;T,胸腺嘧啶)碱基中的DNA含量因个体而异,但它们在给定物种中保持恒定。因此,G+C含量可用于建立分类关系。

分类关系

这种分类还比较16S或23S核糖体RNA序列之间的相似性,以研究细菌群的系统发育。

抗微生物敏感性试验

化合物的抗微生物活性通常通过测量抑制受测微生物生长所需的化合物的最低浓度(MIC-最小抑制浓度)来确定。该试验依赖于抗生素在微生物培养基中的扩散来抑制在其中或其上生长的易感生物的生长。抑制区域被认为代表了微生物的易感性。多年来,抗生素敏感性已成为分类和鉴别的特征之一。

厌氧生长

严格的厌氧细菌的培养带来了特殊的问题,因为这些细菌可能会因暴露在空气中而被杀死。培养基中溶解的氧在代谢电子的存在下形成有毒的自由基和过氧化氢。专性厌氧菌无法解毒这些活性氧。为了在固体培养基上培养非严格的厌氧菌,厌氧缸与释放CO2和H2的Gas-Pak一起使用,释放的氢在钯催化剂存在下与氧气反应生成水,从而从缸中除去氧气。完全厌氧室配备有气闸,并且充满用于培养严格(专性)厌氧菌的惰性气体,可商购获得。

氧化还原电位(O/R电位)

这是培养基中氧化分子与还原分子的比例:举例来说,当氧气溶解在培养基中时,存在的有机化合物变得更加氧化,并且培养基表现出正的氧化还原电位。随着微生物生长消耗氧气,培养基向更负的氧化还原电位移动。严格的厌氧菌需要培养基在生长期间保持非常低(负)的电位。为实现此目的,在高温高压灭菌之前,在培养基中添加还原剂。常用的还原剂是巯基乙酸钠(HS-CH2COONa)或连二亚硫酸钠,可轻松将质子提供给其他化合物。氧化还原电位、pH和微生物生长之间的关系如下图所示。

氧化还原电位、pH和微生物生长之间的关系

图 4.

微生物生长的Eh和pH范围(改编自Zajic 1969):该数据来自若干报告,其中给出的pH和Eh均是针对生长行为的。群组的生长范围很可能超出了图中所示的边界。

微生物生长监测

微生物生长监测

图5

连续稀释

将接种物在排放在平板上的一系列稀释管中稀释。对平板上的菌落数进行计数,并校正稀释度,以计算原始接种物中的生物个数。

最可能个数估计法

统计方法估计已经连续稀释的接种物中存在的细菌的最可能数量。用不同初始体积的接种物制备几个系列;结果记录为一系列阳性,即管中有细菌生长,然后可以计算得到MPN。结果是预期会产生这种结果的微生物的可能数量。

显微镜直接观察法

使用特殊构造的显微镜载玻片,其具有已知体积的浅槽和蚀刻到玻璃中的栅格。在槽中加入细菌悬浮液,测定每个网格方格中的平均细菌数,然后乘以一个因子得到每毫升的细菌个数。选择性染色(使用荧光染料)用于区分环境样品中的细菌与非活体材料。另外还有电子细胞计数器,其自动计算受测液体体积中的细胞数量。

浊度(光密度)

随着细菌繁殖,液体培养基的浊度增加,浊度可以在分光光度计上测量。到达检测器的光量与标准化条件下的细菌数量成反比。样品的吸光度(光密度)取决于细胞的数量、它们的大小和形状,并用来描述细菌的生长。如果吸光度读数与相同培养物的直接计数、其蛋白质含量或干质量相匹配,则相关性可用于将来直接基于浊度测量值估算细菌数量或生物量。

代谢活动

估计细菌数量的另一种间接方法是使用群体的代谢活动。测量代谢产物的量,并假设其与存在的细菌数量成比例。代谢产物的实例包括CO2和有机酸。还可以通过还原测试来测量氧摄取,例如使用亚甲基蓝染料,其在氧气存在下从蓝色变为无色。

细菌培养物保存

冷藏

可用来短期储存。在4 °C下储存时,在琼脂斜面抿上的培养物或者刺入的培养物,可存活数月。培养板必须加以密封以防止变干。为了长时间保存培养物,通常采用以下两种方法:

深度冷冻

将纯细菌培养物重悬于液体中,并在-50℃至-95℃的温度下快速冷冻(通常用液氮)。敏感微生物需要有甘油(最终浓度为15-20%,作为“防冻剂”)或额外蛋白质(脱脂奶粉)提供保护。培养物可以解冻使用,最长可保存数年。

冻干

快速冷冻细菌悬浮液,并通过高度真空除去水分。微生物在粉末状残留物中可存活数年,并且可以随时在营养培养基中重新水合复活。从菌株集中订购的细菌菌株通常以这种形式发运交货。

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