Merck
主页酶活性测定酶法测定淀粉酶活性(淀粉酶活性测定)

酶法测定淀粉酶活性(淀粉酶活性测定)

本测定实验方案适用于利用淀粉酶活性测定试剂盒(MAK009)对细胞和组织培养物上清液、尿液、血浆、血清和其他生物样品中的淀粉酶活性进行比色测定。采用酶偶联法测定淀粉酶活性,该方法中底物亚乙基-pNP-G7被淀粉酶切割,按比例产生比色产物(405 nm)。每单位指25 °C下每分钟切割亚乙基-pNP-G7产生1.0 µmole硝基苯酚所需要的淀粉酶的量。

注意事项和免责声明

本产品仅可用于研发用途,不可用于药物、家用或其他用途。请参阅产品化学品安全技术说明书,获取危害和安全操作方法相关信息。

试剂

淀粉酶测定缓冲液 25 mL
产品编号:MAK009A 淀粉酶混合底物 5 mL 产品编号:MAK009B 淀粉酶阳性对照物 1 vl 产品编号:MAK009C 硝基苯酚标准品 150 µL 产品编号:MAK009D

需自备的试剂和设备

96孔平底板 — 建议使用透明板(产品编号M4436或者等效物)进行比色分析。

分光光度计多孔酶标仪

制备说明

样品瓶启封之前,短暂离心。使用超纯水制备试剂。为维持试剂的完整性,请避免反复冷融循环。

淀粉酶测定缓冲液 — 使用前放置至室温。

淀粉酶阳性对照物 — 加入50 µL淀粉酶测定缓冲液。反复移液以充分混合,等量分装后于-20 °C保存。在溶解后2个月内使用完。

储存方法/稳定性

本试剂盒在湿冰上运输。建议–20°C避光储存。

操作流程

所有样品和标准品应一式两份运行。

用于比色检测的硝基苯酚标准品
在96孔板中分别加入0、2、4、6、8、10 µL 2 mM的硝基苯酚标准品,得到0(空白)、4、8、12、16、20 nmole/孔的标准品。每孔加水至50 µL。

样品制备
将组织(100 mg)或细胞(4 x106)中加入0.5 mL淀粉酶测定缓冲液。均质后在13,000 x g离心10分钟,弃去不溶物。

血清和尿液可以直接加入孔中。

在96孔板上分别加入1-50 µL样品。添加淀粉酶测定缓冲液至每孔50 µL。

注意:对于未知样品,建议测试几份样品稀释液,确保读数在标准曲线的线性范围内。

对于阳性对照物(可选),需在孔中加入5 µL淀粉酶阳性参照物溶液并用淀粉酶测定缓冲液添加至50 µL。

检测反应

  1. 根据表1配制主反应混合物。每个反应(孔)需要100 μL主反应混合物。
表1
  1. 在每个装有样品、标准品和阳性对照物的孔中加入100 µL主反应混合物。使用水平摇床或者移液器充分混合。

  2. 在2-3分钟(Tinitial)后,测量405 nm出的吸光度值(A405)initial
    注意:(A405)initial需要处于标准曲线的线性范围内。

  3. 将板置于25 °C培养,每5分钟测定一次吸光度(A405)。孵育期间确保反应板避光存放。

  4. 继续测量直到活力最高样品的吸光度高于最大浓度标准品(20 nmole/孔)对应的吸光度。此时,活力最高样品的吸光度已接近或超过标准曲线的最大线性范围。

  5. 用于测定酶活力的最终测定吸光度[(A405final] 应该是倒数第二个读数的值即活力最高样品吸光度接近或超过标准曲线最大线性范围之前的那个值(参见步骤5)。倒数第二个读数的时间为Tfinal
    注意:最终测定值必须落在标准曲线的线性范围之内。

结果

计算

从标准品和样品的最终测定值(A405)final中减去硝基苯酚空白对照品的最终测定值(A405)final以校正背景误差。

注意:每次运行测定方案时,都必须绘制新标准曲线。

计算样品从Tinitial 到Tfinal吸光度的变化。

∆A405 = (A405)final – (A405)initial

将每个样品的∆A405与标准曲线进行比较,得出淀粉酶从Tinitial到Tfinal生成的硝基苯酚的量(B)

样品的淀粉酶活性可以通过如下公式计算:

淀粉酶活性 = B x 样品稀释倍数

(反应时间)x V


B = 从Tinitial到Tfinal生成的硝基苯酚的量(nmole)

反应时间 = Tfinal – Tinitial(分钟)

V = 加入孔中的样品体积(mL)

淀粉酶活性的单位是nmole/min/mL。一个单位的淀粉酶是指25 °C下每分钟切割亚乙基-pNP-G7产生1.0 µmole

硝基苯酚所需要的淀粉酶的量。

材料
Loading